Тсс панели что это: Плита ТSS | Полезные советы от мебельной фабрики Стайвер-100

Маркус К.Густафссон

¹ Департамент клеточной биологии и биологии развития, ² Департамент генетики и ³ Penn Center for Development Biology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania 19104, USA

Hua Pan

¹ Департамент клеточной биологии и биологии развития, ² Департамент генетики и ³ Центр биологии развития Пенсильванского университета, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Дебора Ф.Пинни

¹ Департамент клеточной биологии и биологии развития, ² Департамент генетики и ³ Пеннский центр биологии развития, Медицинская школа Университета Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Юнлян Лю

¹ Департамент клеточной биологии и биологии развития, ² Департамент генетики и ³ Центр биологии развития Пенсильванского университета, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Анна Левандовски

¹ Департамент Клеточная биология и биология развития, ² Департамент генетики и ³ Пеннский центр биологии развития, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Дуглас Дж.Эпштейн

¹ Департамент клеточной биологии и биологии развития, ² Департамент генетики и ³ Пеннский центр биологии развития, Медицинская школа Университета Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Чарльз П. Эмерсон, Jr.

¹ Департамент клеточной биологии и биологии развития, ² Департамент генетики и ³ Penn Centre for Development Biology, Медицинский факультет Университета Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

¹ Департамент of Cell and Developmental Biology, ² Департамент генетики и ³ Penn Centre for Developmental Biology, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

⁴ Эти авторы внесли равный вклад в эту работу.

⁵ Автор, ответственный за переписку.

Поступило 24 августа 2001 г .; Принято 1 ноября 2001 г.

Abstract

Sonic hedgehog (Shh) — секретируемая сигнальная молекула для формирования паттерна тканей и спецификации стволовых клеток у эмбрионов позвоночных. Shh опосредует как дальнодействующие, так и краткосрочные сигнальные ответы в эмбриональных тканях посредством активации и репрессии генов-мишеней своими эффекторами фактора транскрипции Gli.Несмотря на хорошо изученные функции передачи сигналов Shh в развитии и заболеваниях человека, гены-мишени для развития регуляции Gli практически неизвестны. В этом исследовании мы исследуем роль передачи сигналов Shh в контроле Myf5 , гена, регулирующего скелетные мышцы, для спецификации мышечных стволовых клеток у эмбрионов позвоночных. В предыдущих генетических исследованиях мы показали, что Shh необходим для экспрессии Myf5 в спецификации дорсальных сомитов, предшественников эпаксиальных мышц.Однако эти исследования не различают, является ли Myf5 прямой мишенью для регуляции Gli посредством передачи сигналов Shh на большие расстояния, или, альтернативно, регуляция Myf5 является вторичным ответом на передачу сигналов Shh. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали трансгенный анализ с репортерными генами lacZ , чтобы охарактеризовать энхансер транскрипции Myf5 , который контролирует активацию экспрессии Myf5 в предшественниках эпаксиальных мышц сомитов у эмбрионов мыши.Этот энхансер эпаксиального сомита (ES) Myf5 является Shh-зависимым, о чем свидетельствует его полная неактивность в сомитах гомозиготных мутантных эмбрионов Shh и его пониженная активность в гетерозиготных мутантных эмбрионах Shh . Более того, Shh и расположенные ниже по ходу трансдукторы сигналов Shh специфически индуцируют репортеры энхансера ES / люциферазы в Shh-чувствительных клетках 3T3. Сайт связывания Gli, расположенный внутри энхансера ES, необходим для активации энхансера передачей сигналов Shh в трансфицированных клетках 3T3 и в предшественниках эпаксиальных сомитов у трансгенных эмбрионов.Эти находки устанавливают, что Myf5 является прямой мишенью для передачи сигналов Shh на большие расстояния посредством позитивной регуляции с помощью факторов транскрипции Gli, обеспечивая доказательства того, что передача сигналов Shh имеет прямую индуктивную функцию в спецификации клеточного клона.

Ключевые слова: Sonic hedgehog, Gli, Myf5, сомиты, спецификация мышц

Sonic hedgehog (Shh) является членом семейства сигнальных молекул Hedgehog (HH). У позвоночных Shh функционирует как морфоген, опосредуя передачу сигналов дальнего и ближнего действия для формирования дорсально-вентрального паттерна в спецификации клонов нервных, мезодермальных и энтодермальных стволовых клеток (Chiang et al.1996; Эриксон и др. 1996; Goodrich et al. 1997; Hebrok et al. 2000; Рамальо-Сантос и др. 2000), для формирования паттерна конечностей (Riddle et al. 1993), для пролиферации гранулярных клеток (Wechsler-Reya and Scott 1999) и для подавления апоптоза тканей (Teillet et al. 1998). Мутации, которые нарушают передачу сигналов Shh, вызывают врожденные дефекты человека (Muenke and Cohen 2000) и предрасположенность к раку у мышей и людей (Goodrich and Scott 1998; Hahn et al. 1999). Передача сигналов Hedgehog у Drosophila контролирует формирование кутикулярного паттерна у эмбрионов и тканевого паттерна во время более позднего развития (Dahmann and Basler 2000).Сигналы HH передаются отвечающим эмбриональным клеткам посредством связывания HH с рецептором Patched (Ingham et al. 1991; Marigo et al. 1996a; Stone et al. 1996; Fuse et al. 1999), который является негативным регулятором передачи сигналов HH в отсутствие лиганда. Связывание HH с Patched блокирует его репрессию другого трансмембранного белка, Smoothened (Smo), который индуцирует передачу сигнала путем активации ядерной транслокации Ci / Gli, факторов транскрипции цинковых пальцев (van den Heuvel and Ingham 1996). У позвоночных передача сигнала HH опосредуется тремя эффекторами фактора транскрипции Gli (Hui et al.1994). Drosophila Ci выполняет двойную функцию. Как необработанная форма Ci опосредует положительные транскрипционные ответы на сигнальную активность Hedgehog, тогда как его процессированные формы функционируют как репрессоры транскрипции (Porter et al. 1995; Aza-Blanc et al. 1997; Chen et al. 1999). В конечности позвоночных Gli3 дифференцированно обрабатывается с образованием репрессора транскрипции в условиях низкой передачи сигналов Shh, обеспечивая механизм, контролирующий дифференциальную активность Gli3 в ответ на передачу сигналов Shh на большие и короткие расстояния (Wang et al.2000). Передача сигналов HH на большие расстояния у эмбрионов требует его автопроцессинга и модификации N-терминального холестерина (Lewis et al. 2001; Zeng et al. 2001), а также гепаран-сульфатных протеогликанов для обеспечения его внеклеточной передачи (Bellaiche et al. 1998). Последовательная передача сигналов Shh обеспечивает позитивную и негативную регуляцию формирования паттерна нервной трубки судьбы нервных клеток (Roelink et al. 1995; Ericson et al. 1997; Briscoe and Ericson 1999), хотя роль белков Gli в этих процессах остается неясной.

Хотя важность передачи сигналов Shh в развитии и заболеваниях человека хорошо установлена, транскрипционные мишени передачи сигналов Shh через факторы транскрипции Gli практически неизвестны. Считается, что в ответ на процессы передачи сигнала, инициированные передачей сигналов HH, факторы транскрипции Gli / Ci подвергаются ядерной транслокации (Robbins et al. 1997; Sisson et al. 1997; Kogerman et al. 1999), что приводит к их связыванию с мотивами последовательности-мишени. в регуляторных элементах генов-мишеней (Kinzler, Vogelstein, 1990; Von Ohlen et al.1997). Gli1 и Gli2 функционируют как положительные регуляторы факторов транскрипции, тогда как обработанный Gli3 функционирует как отрицательный регулятор (Sasaki et al. 1999; Wang et al. 2000). У Drosophila и позвоночных компоненты самого пути передачи сигнала HH подвергаются прямой регуляции положительной и отрицательной обратной связи. Patched Экспрессия положительно регулируется передачей сигналов HH посредством регуляции Gli / Ci, обеспечивая механизм отрицательной обратной связи для передачи сигнала Shh (Alexandre et al.1996; Goodrich et al. 1996; Мариго и др. 1996b). У позвоночных Gli1 также положительно и напрямую регулируется передачей сигналов HH через важные сайты связывания Gli (Lee et al. 1997; Dai et al. 1999), обеспечивая механизм позитивной регуляции передачи сигналов HH. Только несколько онтогенетических регуляторных генов были идентифицированы как прямые мишени регуляции Gli / Ci. У Drosophila передача сигналов HH регулирует Wingless в формировании паттерна кутикулы (Heemskerk and DiNardo 1994) через сайты связывания C (Von Ohlen et al.1997). У эмбрионов позвоночных HNF3-β является регулятором раннего развития хорды и формирования пластинки дна (Ang and Rossant, 1994; Weinstein et al. 1994; Dufort et al. 1998), и его экспрессия в пластине дна контролируется Shh. и регуляция Gli2 (Ding et al. 1998; Matise et al. 1998) посредством энхансера дна пластинки, который имеет важный сайт связывания Gli (Sasaki et al. 1997).

Передача сигналов Shh влияет на множество процессов развития, включая пролиферацию (Wechsler-Reya and Scott, 1999) и апоптоз (Teillet et al.1998; Borycki et al. 1999), что привело к спорам относительно того, обладает ли Shh индуктивными или трофическими сигнальными функциями. В частности, было неизвестно, регулирует ли передача сигналов Shh посредством его эффекторов фактора транскрипции Gli гены-мишени, которые контролируют спецификацию клеточных клонов, или, альтернативно, регулирует ли они гены-мишени, которые обеспечивают выживание и пролиферацию специфических клонов эмбриональных клеток. Чтобы понять функции Shh в спецификации клонов мышечных клеток, мы исследовали роль передачи сигналов Shh в контроле Myf5 , гена фактора транскрипции bHLH, который контролирует спецификацию клонов миогенных стволовых клеток в эмбрионе позвоночных (Rudnicki et al.1993; Таджбахш и др. 1996b). Myf5 активируется в разных анатомических участках эмбриона под контролем отдельных цис -действующих регуляторных элементов (Hadchouel et al. 2000; Summerbell et al. 2000; Carvajal et al. 2001), отвечая на различные сигналы развития ( Munsterberg et al. 1995; Borycki et al. 1998; Tajbakhsh et al. 1998). Эксперименты по генетической индукции и индукции эксплантата установили, что Shh, продуцируемый хордой, является важным сигналом для активации Myf5 в эпаксиальных мышечных предшественниках дорсального сомита, но не в мышечных предшественниках в других участках активации Myf5 и миогенной спецификации в эмбрион (Borycki et al.1999). У мутантных эмбрионов Shh Myf5 не может активироваться специфически в эпаксиальной области сомита при отсутствии локализованных дефектов пролиферации клеток и апоптоза. Однако эти исследования не решили, является ли Myf5 прямой мишенью передачи сигналов Shh посредством регуляции Gli, или, альтернативно, регуляция Myf5 является вторичным ответом на передачу сигналов Shh.

Чтобы исследовать функцию факторов транскрипции Gli в регуляции Myf5 , мы идентифицировали энхансер эпаксиального сомита (ES) Myf5 и охарактеризовали его ответ на передачу сигналов Shh с использованием комбинации подходов трансгенной и клеточной трансфекции.Этот энхансер ES также был идентифицирован среди набора регуляторных элементов в крупномасштабных исследованиях трансгенной экспрессии в домене 650 kb локуса мыши MRF4 / Myf5 (Zweigerdt et al. 1997; Hadchouel et al. 2000; Summerbell и др., 2000; Карвахал и др., 2001). Эти энхансеры контролируют активацию и поддержание экспрессии Myf5 и MRF4 в конечностях, жаберных дугах и предшественниках эпаксиальных и гипаксиальных мышц. Энхансер ES является уникальным в локусе MRF4 / Myf5 из-за его транскрипционной активности в эпаксиальных мышечных предшественниках дорсального сомита.В этом исследовании мы подробно исследовали онтогенетическую активность энхансера ES в сомитах развивающихся эмбрионов дикого типа и гомозиготных и гетерозиготных мутантных эмбрионов Shh (Chiang et al. 1996), а также в Shh-чувствительных клетках 3T3. (Taipale et al. 2000), модель культуры предшественников сомитной мезодермы (Taylor and Jones 1979). Эти исследования показывают, что передача сигналов Shh контролирует активацию энхансера Myf5 ES как в эпаксиальных мышечных клетках-предшественниках во время образования сомитов, так и в клетках 3T3, отвечающих на индукцию Shh.Более того, Shh-регуляция энхансера ES в сомитах и ​​в клетках 3T3 опосредуется через важный сайт связывания фактора транскрипции Gli. Эти находки устанавливают, что Myf5 является прямой мишенью для передачи сигналов Shh на большие расстояния, чтобы контролировать спецификацию клеток-предшественников сомитов эпаксиального миогенного клона. Кроме того, в отличие от конечностей и нервной трубки, где передача сигналов Shh на большие расстояния опосредует негативную регуляцию (Briscoe and Ericson 1999; Wang et al. 2000), мы показали, что Myf5 в дорсальном сомите отвечает на передачу сигналов Shh посредством положительной регуляции. с помощью факторов транскрипции Gli, установив, что дальнодействующая передача сигналов Shh выполняет прямую транскрипционную функцию в регуляции Myf5 для спецификации эпаксиальных мышечных предшественников.

Результаты

Энхансер транскрипции Myf5, специфичный для эпаксиальных мышечных предшественников сомитов

Клон ВАС локуса MRF4 / Myf5 был выделен из библиотеки геномной ДНК мыши, и субклоны были охарактеризованы анализом последовательности и функциональными анализами энхансера с использованием временных трансгенез с использованием репортера гена lacZ , экспрессируемого под контролем гетерологичного вирусного промотора tk (Goldhamer et al. 1992). Эти исследования идентифицировали энхансер длиной 651 п.н., расположенный в 6.6 kb 5 ‘сайта начала транскрипции Myf5 (Tajbakhsh et al. 1996a) во внутригенной области MRF4 / Myf5 (рис.). Этот энхансер Myf5 из 651 п.н. активирует экспрессию репортера в мышцах-предшественниках эпаксиального сомита, а также в клетках мозга у эмбрионов через 9,5 дней после полового акта (dpc) (рис.) И имеет обширную (86%) идентичность с эквивалентной областью 3 ‘ крыса MRF4 (Pin et al. 1997), включая консервативную последовательность, родственную последовательностям сайта связывания Gli (Kinzler and Vogelstein 1990).

Организация энхансера Myf5 ES в локусе MRF4 / Myf5 и трансгене lacZ . Энхансерный элемент Myf5 ES длиной 651 п.н. расположен на 6,6 т.п.н. выше сайта транскрипции Myf5 , рядом с 3′-концом гена MRF4 . Транскрипционную активность энхансера ES оценивали с использованием трансгена lacZ с вирусным промотором tk, как показано. Кандидат Gli-связывающий сайт (Gli ^wt enh) расположен на 470 п.н. в энхансере.Центральная область сайта связывания Gli в энхансере ES Myf5 (красный прямоугольник) является вариантом в положении 477 от консенсусного сайта связывания Gli, определенного выбором сайта (Kinzler and Vogelstein 1990), и в позициях 472 и 477 из Сайт Gli в энхансере дна пластины HNF-3β (Sasaki et al. 1997). Мутации с заменой нуклеотидов, введенные в эту последовательность Gli (Gli ^mut enh), нарушают ее Gli-связывающую и функциональную активность.

Энхансер Myf5 ES / lacZ трансген активируется в головном мозге и в эпаксиальных сомитах в координации с образованием сомитов.( A ) Экспрессию трансгена энхансера ES / lacZ анализировали гистоэнзиматическим окрашиванием β-gal целых препаратов 8,25–11,5-dpc-эмбрионов, выделенных от самок зародышевой линии E1, гетерозиготных по энхансеру ES / lacZ трансген. Специфическое окрашивание было обнаружено в головном мозге (красная стрелка) на всех стадиях и во всех сомитах вдоль передней и задней оси эмбриона на ранних стадиях (панели a — c ) и преимущественно в восьми задних сомитах новорожденных на более поздних стадиях. сцены (панели д, е ).Эктопическое окрашивание дорсальной нервной трубки часто встречается у трансгенных эмбрионов зародышевой линии E1 (белая стрелка), но не у транзиторных трансгенных эмбрионов (см. Рис. A). При 8,25 dpc ( a ) окрашивание наблюдается в затылочных сомитах, которые являются первыми сомитами, образованными в эмбрионе, а при 8,75 dpc ( b ) и 9,5 dpc ( c ) окрашивание наблюдается в сомитах. вдоль всей оси, включая новейшие задние сомиты (красные скобки). К 10,5 dpc окрашивание преобладает в восьми новейших задних сомитах (красная скобка), и только рассеянное окрашивание наблюдается в более зрелых передних сомитах.Эмбрион размером 9,5 dpc ( c ) был разрезан поперек вдоль передней к задней оси эмбриона в самом заднем, новообразованном эпителиальном сомите (панель c1 ), непосредственно переднем сомите, который сформировал дермотом и дорсальную медиальную губу. ( c2 ) и передний сомит, инициировавший образование миотома ( c3 ). (s) склеротом; (дм) дермомиотом; (мой) миотом; (dml) дорсальная медиальная губа; (нт) нервная трубка; (NC) нотохорд. ( B ) Экспрессию трансгена EShancer / lacZ анализировали на эмбрионах на 9.0 dpc путем гибридизации in situ целиком (ISH) с использованием антисмысловых DIG-зондов Myf5 (панель a ) и lacZ антисмысловых DIG-зондов (панель b ), а также путем гистоферментного окрашивания β-галлов целиком ( панель c ). Стрелки и скобки разграничивают границы экспрессии трансгена lacZ и транскрипта Myf5 в эпаксиальном сомите, как это было определено этими различными методами. Транскрипты lacZ , экспрессируемые трансгеном ES-энхансера / lacZ , локализуются только в самом дорсальном аспекте эпаксиального сомита ( b ), тогда как активность фермента β-gal в более передних сомитах имеет более широкое распределение от дорсального до вентрального. , простираясь от дорсального эпаксиального домена к более вентральному положению, где формируется миотом.

Гистоэнзиматический анализ экспрессии β-галактозидазы (β-gal) показал, что трансген Myf5 ES энхансер / lacZ активируется в сомитах эмбрионов уже в 8,25 dpc, когда сомиты впервые образуются и хромосомный Myf5 активируется сначала активируется в предшественниках эпаксиальных мышц. Myf5 Активация координируется с образованием сомитов, и экспрессия сохраняется во вновь образованных сомитах до 11,5 dpc, когда формирование сомитов завершено (Fig. A).Экспрессия также может быть обнаружена в головном мозге на этих стадиях развития (Daubas et al. 2000), а также в передней нервной трубке в двух исследованных трансгенных линиях зародышевой линии, E1 и E2. Экспрессия нервной трубки не наблюдалась у транзиторных трансгенных эмбрионов (см. Рис. А ниже). Экспрессия в головном мозге локализована в области медиального продольного пучка и маммиллотегментарных трактов, где экспрессируется Myf5 (Daubas et al. 2000), хотя окрашенные β-gal клетки занимают более широкий домен, чем сообщается в анализах гибридизации in situ. Myf5 расшифровки.У эмбрионов от 8,25 до 9,5 dpc окрашивание β-gal обильно в сомитах вдоль всей передне-задней оси, включая новейшие сформированные сомиты в заднем эмбрионе (Рис. A, панели a – c). Эта активность репортерного гена повторяет экспрессию хромосомного Myf5 и предшествует экспрессии всех других регуляторных факторов мышц, включая MRF4 (Ott et al. 1991; Tajbakhsh et al. 1997). На более поздних стадиях развития активность β-gal преимущественно локализуется в восьми новейших образовавшихся сомитах, где сначала активируется Myf5 (Tajbakhsh et al.1996a), а активность значительно снижается в более зрелых передних сомитах, в которых только несколько окрашенных клеток обнаруживаются в миотоме и дермотоме (Fig. A, панели d, e). Эти паттерны экспрессии сомитов устанавливают, что энхансер ES контролирует активацию транскрипции Myf5 во вновь образованных сомитах, но не поддерживает его экспрессию во время созревания сомитов.

Активация энхансера ES Myf5 ES в сомитах и ​​головном мозге опосредуется его Gli-связывающей последовательностью.Конструкции энхансера Myf5 ES / lacZ , содержащие сайт связывания Gli дикого типа (Gli ^wt enh) или мутантный (Gli ^mut enh), вводили в эмбрионы для транзиторного трансгенеза с помощью парануклеарной инъекции. Эмбрионы выделяли при 8,5 и 9,5 dpc, генотипировали для идентификации трансгенных эмбрионов и анализировали на экспрессию репортера путем окрашивания β-gal. ( A, левая панель ) Эмбрион 9,5 dpc, экспрессирующий трансген Gli ^wt enh дикого типа с репортерной активностью в сомитах и ​​головном мозге (красная стрелка).( Правая панель ) 9,5-dpc Gli ^mut enh трансгенный эмбрион с эктопической экспрессией трансгена в вентральном сомите (белая стрелка), но не в дорсальном эпаксиальном сомите. Этот эмбрион был единственным из 24 трансгенных эмбрионов Gli ^mut enh, у которых наблюдалось эктопическое окрашивание сомитов. ( B ) Табличная сводка экспрессии трансгена Gli ^wt enh и Gli ^mut enh в сомитах трансгенных эмбрионов с 8,5 и 9,5 dpc.Экспрессия эпаксиального сомита мутантного энхансера Gli полностью блокируется. Только один 9,5-dpc-эмбрион Gli ^mut enh (*), показанный в A , имел эктопическую экспрессию в сомите.

Чтобы исследовать дорсально-вентральный паттерн активности энхансера ES в сомитах, эмбрионы, окрашенные β-gal, были разделены вдоль их передней и задней осей с шагом 9,5 dpc, когда сомиты окрашены вдоль всей оси (рис. A, панели c1– c3). Усиливающая активность обнаруживается в первом, новейшем сомите в заднем эмбрионе, и эта экспрессия локализована в кластере дорсальных медиальных сомитных клеток, которые, как известно, активируют хромосомный Myf5 для спецификации эпаксиальных мышечных клеток-предшественников (Tajbakhsh et al.1997). Усиливающая активность не была обнаружена в пресомитной мезодерме на любой стадии развития у транзиторных трансгенных эмбрионов или трансгенных эмбрионов зародышевой линии. В более задних сомитах экспрессия трансгена локализована только на дорсальной медиальной губе (DML) дермомиотома, который является пролиферативным источником клеток-предшественников, которые формируют первые эпаксиальные мышцы миотома эмбриона. Окрашивание β-галактозидазой сохраняется в этих предшественниках DML в более зрелых передних сомитах, которые инициировали образование миотома, но большое количество окрашенных клеток также заселяет дорсальный аспект миотома и дорсальный аспект вышележащего дермотома, которые образованы дорсальной и вентральная миграция клеток DML к этим сайтам (Ordahl et al.2001). Ранее окрашивание β-gal трансгенных линий dermotome ES энхансера / lacZ интерпретировалось как эктопическая активность энхансера, который, как полагали, лишен негативного регуляторного элемента (Summerbell et al. 2000). Альтернативно, окрашивание дермотома и миотома β-gal может отражать персистентность фермента β-gal в отсутствие устойчивой транскрипционной активности трансгена ES / lacZ . Чтобы различить эти возможности, мы сравнили экспрессию трансгена энхансера ES / lacZ с использованием окрашивания ферментом β-gal с анализами гибридизации in situ целиком для обнаружения транскриптов β-gal (рис.Б, панели а – в). Эти эксперименты показывают, что lacZ РНК-транскриптов ограничены DML во всех сомитах, включая передние сомиты. Транскрипты не были обнаружены в дермотоме или миотоме, где активность фермента β-gal накапливается и сохраняется во время созревания сомита. Сходная локализация транскриптов β-gal наблюдалась в исследованиях экспрессии трансгенов lacZ , контролируемой более крупной последовательностью 23 т.п.н. перед промотором Myf5 , который включал энхансер ES (Hadchouel et al.2000). Эти данные устанавливают, что энхансер Myf5 ES транскрипционно активен только в эпаксиальных мышечных клетках-предшественниках DML, и его транскрипционная активность не поддерживается, поскольку клетки DML мигрируют дорсально и вентрально с образованием как миотома, так и дермотома, таким образом опровергая возможность что отрицательный регуляторный элемент необходим для локальной экспрессии энхансера ES в мышечных предшественниках эпаксиальных сомитов.

Энхансер Myf5 ES имеет функциональный сайт связывания фактора транскрипции Gli

Энхансер Myf5 ES имеет элемент последовательности, связанный с Gli-связывающими последовательностями (рис.; Кинзлер и Фогельштейн 1990; Сасаки и др. 1997), предполагая, что этот энхансер является прямой мишенью индукции Shh посредством регуляции фактора транскрипции Gli. Поскольку сайты связывания Gli в энхансерах транскрипции ранее не были хорошо задокументированы, мы выполнили анализы связывания сдвига электрофоретической подвижности, чтобы проверить, связывает ли этот элемент последовательности Myf5 Gli белки. Меченый Myc белок Gli2, экспрессируемый в системе экспрессии ретикулоцитов, реагировал с радиоактивно меченными олигонуклеотидами последовательности Gli энхансера Myf5 ES, и комплексы белок-ДНК анализировали с помощью анализов сдвига электрофоретической подвижности.Мы обнаружили, что белок Gli2, продуцируемый в экстрактах ретикулоцитов, образует стабильные комплексы ДНК-белок с целевой последовательностью энхансера Myf5 , и эти комплексы могут быть суперсмещены с помощью анти-myc антител, показывая, что эти комплексы образуются путем связывания меченного myc Gli2 белка к последовательности энхансера Myf5 (рис. A). Связывание белка Gli2 с сайтом энхансера ES является последовательностным и основано на конкуренции с избытком олигонуклеотида Gli дикого типа (Gli ^wt ), но не с избытком олигонуклеотидов Gli ^mut с мутациями замещения оснований, которые разрушают ядро ​​ДНК Gli. -последовательность привязки (см. рис.). Ядерные меченные Myc белки Gli1 и Gli2, экспрессируемые в клетках 293 и миобластах C2C12, также специфически связываются с олигонуклеотидами Gli ^wt в этих анализах сдвига геля (данные не показаны), обеспечивая подтверждающие доказательства того, что факторы транскрипции Gli могут специфически связываться с сайтом Gli в усилитель Myf5 .

Идентификация функционального сайта связывания Gli в энхансере Myf5 ES. ( A ) Анализы сдвига подвижности с помощью электрофореза показывают, что меченный Myc белок Gli2, экспрессируемый в лизатах ретикулоцитов (лизат TNT), связывается и образует комплекс сдвига геля с радиоактивно меченным ³² P олигонуклеотидом из 32 п.н. энхансера ES дикого типа. введите сайт Gli (mGli2-myc).100-кратный избыток олигонуклеотида Gli сайта дикого типа (Gli ^wt ) конкурирует за связывание Gli2-myc с радиоактивно меченным олигонуклеотидом дикого типа, тогда как мутантный олигонуклеотид Gli сайта (Gli ^mut ) не конкурирует за связывание. Анти-Myc антитела (myc Ab) суперсдвигающие комплексы Gli2 – myc гелевого сдвига, тогда как контрольные антитела (мышиный IgG) не имеют эффекта, показывая, что Gli2 является основным компонентом этих гелевых сдвигающих комплексов. ( B ) Люциферазные репортеры 8 × мультимеризованных сайтов связывания Gli дикого типа (8 × Gli ^wt ) и 8 × мутантных сайтов связывания Gli (8 × Gli ^mut ) из энхансера ES Myf5 котрансфицировали в Клетки 3T3 с векторами экспрессии mGli1 или mGli2 мыши.Результаты выражены в виде кратности индукции, которая представляет собой отношение активности люциферазы, индуцированной в клетках, трансфицированных Gli, к базовой активности люциферазы в контрольных трансфицированных клетках 3Т3. И Gli1, и Gli2 являются сильными активаторами транскрипции репортера 8 × Gli ^wt , но не репортером 8 × Gli ^mut , что показывает, что сайт связывания Gli энхансера ES может образовывать активные транскрипционные комплексы с факторами транскрипции Gli, синтезируемыми in vivo. .

Чтобы проверить, образует ли связывание Gli с сайтом связывания Gli энхансера ES активный транскрипционный комплекс, Shh-чувствительные клетки 3T3 (Taipale et al.2000) были котрансфицированы генами-репортерами люциферазы из 8-ми мультимеризованных генов дикого типа (8x Gli ^wt ) и мутантных (8x Gli ^mut ) Gli-связывающих сайтов, с векторами экспрессии Gli1 или Gli2 и со ссылкой Renilla. плазмида (рис. Б). Репортер 8 × Gli ^wt трансактивирован в 500 раз с помощью Gli1 и в 30 раз с помощью экспрессионных векторов Gli2, тогда как 8 × Gli ^mut не трансактивируется ни Gli1, ни Gli2. Эти биохимические и функциональные исследования, следовательно, устанавливают, что энхансер Myf5 ES имеет функциональный сайт связывания Gli для регуляции Shh.

Shh контролирует активацию энхансера Myf5 ES и эпаксиальную экспрессию эндогенного Myf5 et al. 1996), которые затем были скрещены для получения пометов 9,0–9,5-dpc гетерозиготных (+/–) и гомозиготных (- / -) мутантных эмбрионов

Myf5 ES-энхансер / репортерные плазмиды люциферазы были созданы путем субклонирования последовательности энхансера Myf5 ES длиной 651 п.н. (Gli ^mut enh) Gli-связывающий сайт в репортере люциферазы pδ51lucII, который имеет δ-кристаллический промотор с низкой базальной активностью в анализах трансфекции ДНК. 8 × репортерных плазмид Gli / люциферазы были созданы субклонированием в репортер люциферазы pδ51lucII 8 × мультимеров дикого типа (8 × Gli ^wt , 5′-AACGACCACCAAGAAACA-3 ‘) и мутанта (8 × Gli ^mut , 5′-AACGACtgCagAGAAACA-3 ‘) Gli-связывающий сайт, присутствующий в энхансере ES из 651 bp Myf5 .Эти мультимеры были получены в виде прямых повторов путем синтеза олигонуклеотидов. Вектор экспрессии Gli2 мыши получали путем субклонирования Gli2 (Sasaki et al. 1999) в векторы-теги pGEM myc, в результате чего получали pGEM Gli2-myc, меченный С-концом.

выполняли путем высевания конфлюэнтных культур 3T3 на 6- или 12-луночные планшеты при разведении 1: 6 в среде DMEM с добавлением 10% телячьей сыворотки. Через 18 ч клетки котрансфицировали плазмидой люциферазы Renilla (pRL-TK, Promega; 5% мас. ДНК) и плазмидами-энхансерами люциферазы Myf5, ES или репортерными плазмидами люциферазы 8 × Gli (45%) и Gli1, Gli2, Shh или SmoM2 экспрессирующие плазмиды (50%) с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 (Roche) (1 мкг / лунка в 6-луночных планшетах или 500 нг / лунка в 12-луночных планшетах) в соотношении 3: 1 (об. / Мас. ) реагента к ДНК.Через два часа после добавления ДНК клетки промывали и культивировали в 0,5% сывороточной среде, содержащей форсколин или циклопамин или не содержащую (контроль). Через 24 часа клетки лизировали и проводили анализ люциферазы, как описано ранее (Dhoot et al. 2001). Активность люциферазы в каждом образце культуры нормализовали по активности люциферазы Renilla для корректировки вариаций эффективности трансфекции.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Белок Gli2 был синтезирован с помощью TNT-связанной транскрипции / трансляции (Promega) с использованием плазмиды pGEM – Gli2 – myc в качестве матрицы.Для анализа сдвига электрофоретической подвижности 5 мкл экстрактов трансляции Gli2-myc инкубировали на льду в течение 45 мин с 5 × 10 ⁴ имп / мин ³² P-меченного двухцепочечного олигонуклеотида Gli дикого типа (Gli ^wt , 5′-GGGAAAAAACGACCACCA AGAAACACAGT-3 ‘) и мутант Gli (Gli ^mut , 5′-GGGAAAA AACGACtgCagAGAAACACAGT-3′) сайтов связывания в 20 мкл, содержащих 20 мМ Tris (pH 7,9), 1 мМ β NaCl -меркаптоэтанол, 0,1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина и 10% (об. / об.) глицерина.В конкурентных анализах во время предварительной инкубации добавляли 100-кратный избыток немеченого конкурента Gli ^wt или олигонуклеотида Gli ^mut . В анализах суперсмещения 4 мкг моноклонального антитела Myc (9E10) добавляли к связывающей смеси на льду в течение 1 ч перед добавлением радиоактивно меченного зонда. Связанные комплексы разделялись электрофорезом на 5% полиакриламидных гелях в 0,25 × буфере ТВЕ, и радиоактивность определялась авторадиографией.

Благодарности

Авторы благодарят Penn Center for Developmental Biology Transgenic Users Group и Дайан Чжоу за производство временных трансгенных эмбрионов, LiYa Yu за отличную техническую помощь и Penn Institute for Human Gene Therapy Mouse Transgenic Core Mouse за производство зародыша. -линии трансгенных мышей.Авторы также благодарят P. Beachy за предоставление вектора экспрессии Activated Smoothened (SmoM2) и образцы циклопамина, Chin Chiang за предоставление мутантных мышей Shh и H. Sasaki за предоставление векторов экспрессии Gli1 и Gli2. Работа финансировалась за счет грантов C.P.E. от Марша десятицентовиков и NICHD.

Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Таким образом, данная статья должна быть помечена как «реклама» в соответствии с разделом 18 USC 1734 исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

Сноски

ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА ude.nnepu.dem.liam@cnosreme; ФАКС (215) 898-9871.

Статьи и публикации находятся по адресу http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.940702.

Ссылки

• Александр C, Хасинто A, Ingham PW. Активация транскрипции генов-мишеней hedgehog в Drosophila опосредуется непосредственно белком cubitus interruptus, членом семейства GLI ДНК-связывающих белков цинкового пальца. Genes & Dev. 1996; 10: 2003–2013.[PubMed] [Google Scholar]
• Ang SL, Россант Дж. HNF-3β необходим для образования узлов и хорды в развитии мышей. Клетка. 1994; 78: 561–574. [PubMed] [Google Scholar]
• Aza-Blanc P, Ramirez-Weber FA, Laget MP, Schwartz C, Kornberg TB. Протеолиз, который ингибируется hedgehog, направляет белок Cubitus interruptus в ядро ​​и превращает его в репрессор. Клетка. 1997; 89: 1043–1053. [PubMed] [Google Scholar]
• Bellaiche Y, The I, Perrimon N. Tout-velu является Drosophila, гомологом предполагаемого опухолевого супрессора EXT-1 и необходим для диффузии Hh.Природа. 1998. 394: 85–88. [PubMed] [Google Scholar]
• Borycki A-G, Mendham L, Emerson CP., Jr. Контроль формирования паттерна сомитов с помощью Sonic hedgehog и его нижележащих генов сигнального ответа. Разработка. 1998; 125: 777–790. [PubMed] [Google Scholar]
• Borycki AG, Brunk B, Tajbakhsh S, Buckingham M, Chiang C, Emerson CP., Jr Sonic hedgehog контролирует определение эпаксиальных мышц посредством активации Myf5. Разработка. 1999; 126: 4053-4063. [PubMed] [Google Scholar]
• Борицкий А., Браун А.М., Эмерсон С.П., Jr Shh и Wnt сигнальные пути сходятся, чтобы контролировать активацию гена Gli в сомитах птиц. Разработка. 2000; 127: 2075–2087. [PubMed] [Google Scholar]
• Бриско Дж., Эриксон Дж. Спецификация нейрональной идентичности с помощью градуированной передачи сигналов Sonic hedgehog. Semin Cell Dev Biol. 1999; 10: 353–362. [PubMed] [Google Scholar]
• Карвахал Дж. Дж., Кокс Д., Саммербелл Д., Ригби П. У. Трансгенный анализ ВАС локуса Mrf5 / Myf5 выявляет встречно-штыревые элементы, которые контролируют активацию и поддержание экспрессии генов во время развития мышц.Разработка. 2001; 128: 1857–1858. [PubMed] [Google Scholar]
• Chen CH, von Kessler DP, Park W, Wang B, Ma Y, Beachy PA. Ядерный трафик Cubitus interruptus в регуляции транскрипции экспрессии гена-мишени Hedgehog. Клетка. 1999. 98: 305–316. [PubMed] [Google Scholar]
• Чианг К., Литингтунг Й., Ли Э., Янг К.Э., Корден Д.Л., Вестфаль Х., Бичи, штат Пенсильвания. Циклопия и дефект осевого паттерна у мышей, лишенных функции гена sonic hedgehog. Природа. 1996. 383: 407–413. [PubMed] [Google Scholar]
• Дахманн К., Баслер К.Противопоставление транскрипционных выходов передачи сигналов Hedgehog и закрепленного контроля компартментальной клеточной сортировки на границе Drosophila A / P. Клетка. 2000; 100: 411–422. [PubMed] [Google Scholar]
• Dai P, Akimaru H, Tanaka Y, Maekawa T., Nakafuku M, Ishii S. Индуцированная Sonic hedgehog активация промотора Gli1 опосредуется GLI3. J Biol Chem. 1999; 274: 8143–8152. [PubMed] [Google Scholar]
• Daubas P, Tajbakhsh S, Hadchouel J, Primig M, Buckingham M. Myf5 — это новый ранний аксональный маркер в мозге мышей, который подвергается посттранскрипционной регуляции в нейронах.Разработка. 2000; 127: 319–331. [PubMed] [Google Scholar]
• Dhoot GK, Gustafsson MK, Ai X, Sun W., Standiford DM, Emerson CP., Jr. Регулирование передачи сигналов Wnt и формирование паттерна эмбриона внеклеточной сульфатазой. Наука. 2001; 293: 1663–1666. [PubMed] [Google Scholar]
• Дин К., Мотояма Дж., Гаска С., Мо Р., Сасаки Х., Россант Дж., Хуэй С.К. Снижение передачи сигналов Sonic hedgehog и отсутствие дифференцировки дна пластинки у мутантных Gli2 мышей. Разработка. 1998; 125: 2533–2543. [PubMed] [Google Scholar]
• Дюфорт Д., Шварц Л., Харпал К., Россант Дж.Фактор транскрипции HNF3β необходим в висцеральной энтодерме для нормального морфогенеза примитивной полоски. Разработка. 1998; 125: 3015–3025. [PubMed] [Google Scholar]
• Эриксон Дж., Мортон С., Каваками А., Ролинк Х., Джесселл TM. Два критических периода передачи сигналов Sonic hedgehog необходимы для спецификации моторных нейронов. Клетка. 1996. 87: 661–673. [PubMed] [Google Scholar]
• Эриксон Дж., Бриско Дж., Рашбасс П., ван Хейнинген В., Джессел Т.М. Градиентная передача сигналов Sonic hedgehog и спецификация клеточной судьбы в вентральной нервной трубке.Колд Спринг Харб Symp Quant Biol. 1997; 62: 451–466. [PubMed] [Google Scholar]
• Fan CM, Porter JA, Chiang C, Chang DT, Beachy PA, Tessier-Lavigne M. Индукция склеротома дальнего действия с помощью Sonic hedgehog: прямая роль продукта аминоконцевого расщепления и модуляция сигнальный путь циклического АМФ. Клетка. 1995. 81: 457–465. [PubMed] [Google Scholar]
• Fuse N, Maiti T, Wang B, Porter JA, Hall TM, Leahy DJ, Beachy PA. Белок Sonic hedgehog сигнализирует не как гидролитический фермент, а как очевидный лиганд для патчинга.Proc Natl Acad Sci. 1999; 96: 10992–10999. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Goldhamer DJ, Faerman A, Shani M, Emerson CP., Jr. Регуляторные элементы, которые контролируют специфичную для клонов экспрессию myoD. Наука. 1992; 256: 538–542. [PubMed] [Google Scholar]
• Goldhamer DJ, Brunk BP, Faerman A, King A, Shani M, Emerson CP., Jr. Эмбриональная активация гена myoD регулируется высококонсервативным дистальным элементом управления. Разработка. 1995; 121: 637–649. [PubMed] [Google Scholar]
• Гудрич Л.В., Скотт М.П.Ежик и залатал нервную систему и болезнь. Нейрон. 1998; 21: 1243–1257. [PubMed] [Google Scholar]
• Гудрич Л.В., Джонсон Р.Л., Миленкович Л., МакМахон Дж., Скотт М. Сохранение пути передачи сигналов hedgehog / patched от мух к мышам: индукция гена, патченного мышью, с помощью hedgehog. Genes & Dev. 1996; 10: 301–312. [PubMed] [Google Scholar]
• Гудрич Л.В., Миленкович Л., Хиггинс К.М., Скотт М.П. Измененные судьбы нервных клеток и медуллобластома у мутантов с заплатой у мышей. Наука.1997. 277: 1109–1113. [PubMed] [Google Scholar]
• Hadchouel J, Tajbakhsh S, Primig M, Chang TH, Daubas P, Rocancourt D, Buckingham M. Модульное регулирование myf5 на больших расстояниях выявляет неожиданную гетерогенность между скелетными мышцами эмбриона мыши. Разработка. 2000; 127: 4455–4467. [PubMed] [Google Scholar]
• Хан Х., Войновски Л., Миллер Г., Циммер А. Патченный сигнальный путь в онкогенезе и развитии: уроки на животных моделях. J Mol Med. 1999; 77: 459–468. [PubMed] [Google Scholar]
• Хеброк М., Ким С.К., Сент-Жак Б., МакМахон А.П., Мелтон Д.А.Регуляция развития поджелудочной железы с помощью передачи сигналов hedgehog. Разработка. 2000; 127: 4905–4913. [PubMed] [Google Scholar]
• Heemskerk J, DiNardo S. Drosophila hedgehog действует как морфоген в формировании клеточного паттерна. Клетка. 1994; 76: 449–460. [PubMed] [Google Scholar]
• Hirsinger E, Duprez D, Jouve C, Malapert P, Cooke J, Pourquie O. Noggin действует после Wnt и Sonic hedgehog, чтобы противодействовать BMP4 в формировании паттерна птичьего сомита. Разработка. 1997; 124: 4605–4614. [PubMed] [Google Scholar]
• Hui CC, Slusarski D, Platt KA, Holmgren R, Joyner AL.Экспрессия трех мышиных гомологов гена полярности сегмента Drosophila cubitus interruptus, Gli, Gli-2 и Gli-3, в тканях, происходящих из эктодермы и мезодермы, предполагает множественные роли во время постимплантационного развития. Dev Biol. 1994; 162: 402–413. [PubMed] [Google Scholar]
• Ingham PW, Taylor AM, Nakano Y. Роль патченного гена Drosophila в позиционной передаче сигналов. Природа. 1991; 353: 184–187. [PubMed] [Google Scholar]
• Kinzler KW, Vogelstein B.Ген GLI кодирует ядерный белок, который связывает определенные последовательности в геноме человека. Mol Cell Biol. 1990; 10: 634–642. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Когерман П., Гримм Т., Когерман Л., Краузе Д., Унден А.Б., Сандштедт Б., Тофтгард Р., Зафиропулос П.Г. Супрессор слияния млекопитающих модулирует ядерно-цитоплазматическое перемещение Gli-1. Nat Cell Biol. 1999; 1: 312–319. [PubMed] [Google Scholar]
• Крюгер М., Меннерих Д., Фис С., Шафер Р., Мундлос С., Браун Т. Ежик Соник — фактор выживания гипаксиальных мышц во время развития мышей.Разработка. 2001; 128: 743–752. [PubMed] [Google Scholar]
• Lee J, Platt KA, Censullo P, Ruiz i Altaba A. Gli1 является мишенью Sonic hedgehog, которая вызывает развитие вентральной нервной трубки. Разработка. 1997; 124: 2537–2552. [PubMed] [Google Scholar]
• Льюис П.М., Данн депутат, МакМахон Дж. А., Логан М., Мартин Дж. Ф., Сен-Жак Б., МакМахон А. П.. Модификация холестерина Sonic hedgehog необходима для активности передачи сигналов на большие расстояния и эффективной модуляции передачи сигналов с помощью Ptc1. Клетка. 2001; 105: 599–612.[PubMed] [Google Scholar]
• Marcelle C, Stark MR, Bronner-Fraser M. Координированные действия BMP, Shh и Noggin опосредуют формирование паттерна дорсального сомита. Разработка. 1997; 124: 3955–3963. [PubMed] [Google Scholar]
• Мариго В., Дэйви Р.А., Цзо Й., Каннингем Дж. М., Табин С. Джей. Биохимическое свидетельство того, что пропатчен рецептор Hedgehog. Природа. 1996a; 384: 176–179. [PubMed] [Google Scholar]
• Мариго В., Скотт М.П., ​​Джонсон Р.Л., Гудрич Л.В., Табин С.Дж. Консервация в передаче сигналов hedgehog: индукция гомолога цыпленка с помощью Sonic hedgehog в развивающейся конечности.Разработка. 1996b; 122: 1225–1233. [PubMed] [Google Scholar]
• Матиз М.П., ​​Эпштейн Д.И., Парк Х.Л., Платт К.А., Джойнер А.Л. Gli2 необходим для индукции пластинки дна и соседних клеток, но не для большинства вентральных нейронов центральной нервной системы мышей. Разработка. 1998. 125: 2759–2770. [PubMed] [Google Scholar]
• McMahon JA, Takada S, Zimmerman LB, Fan CM, Harland RM, McMahon AP. Noggin-опосредованный антагонизм передачи сигналов BMP необходим для роста и формирования паттерна нервной трубки и сомита.Genes & Dev. 1998; 12: 1438–1452. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мо Р, Фрир А.М., Зиник Д.Л., Крэковер М.А., Мишо Дж., Хенг Х.Х., Чик К.В., Ши Х.М., Цуй Л.К., Ченг С.Х. и др. Специфические и повторяющиеся функции генов цинковых пальцев Gli2 и Gli3 в формировании паттерна и развитии скелета. Разработка. 1997. 124: 113–123. [PubMed] [Google Scholar]
• Мотояма Дж., Лю Дж., Мо Р, Дин Кью, Пост М, Хуэй С.К. Важная функция Gli2 и Gli3 в формировании легких, трахеи и пищевода.Нат Жене. 1998. 20: 54–57. [PubMed] [Google Scholar]
• Мюнке М., Коэн М.М., мл. Генетические подходы к пониманию развития мозга: голопрозэнцефалия как модель. Ment Retard Dev Disabil Res Rev.2000; 6: 15–21. [PubMed] [Google Scholar]
• Мюнстерберг А.Е., Китаевски Дж., Бамкрот Д.А., МакМахон А.П., Лассар А.Б. Комбинаторная передача сигналов членами семейства Sonic hedgehog и wnt индуцирует миогенную экспрессию гена bHLH в сомите. Genes & Dev. 1995; 9: 2911–2922. [PubMed] [Google Scholar]
• Ордал С.П., Бердуго Э., Вентерс С.Дж., Денеткло В.Ф.Дорсомедиальная губа дермомиотома управляет ростом и морфогенезом как первичного миотома, так и эпителия дермомиотома. Разработка. 2001; 128: 1731–1744. [PubMed] [Google Scholar]
• Отт МО, Бобер Э., Лайонс Дж., Арнольд Х., Бакингем М. Ранняя экспрессия миогенного регуляторного гена myf-5 в клетках-предшественниках скелетных мышц эмбриона мыши. Разработка. 1991; 111: 1097–1107. [PubMed] [Google Scholar]
• Park HL, Bai C, Platt KA, Matise MP, Beeghly A, Hui CC, Nakashima M, Joyner AL.Мутанты Gli1 мыши жизнеспособны, но имеют дефекты передачи сигналов SHH в сочетании с мутацией Gli2. Разработка. 2000; 127: 1593–1605. [PubMed] [Google Scholar]
• Patapoutian A, Miner JH, Lyons GE, Wold B. Изолированные последовательности из связанных генов Myf-5 и MRF4 управляют различными паттернами мышечно-специфической экспрессии у трансгенных мышей. Разработка. 1993. 118: 61–69. [PubMed] [Google Scholar]
• Pin CL, Ludolph DC, Cooper ST, Klocke BJ, Merlie JP, Konieczny SF. Дистальные регуляторные элементы контролируют экспрессию гена MRF4 в популяциях ранних и поздних миогенных клеток.Dev Dyn. 1997. 208: 299–312. [PubMed] [Google Scholar]
• Портер Дж. А., фон Кесслер Д. П., Эккер С. К., Янг К. Э., Ли Дж. Дж., Моисей К., Бичи, штат Пенсильвания. Продукт автопротеолитического расщепления hedgehog активен в локальной и дальнодействующей передаче сигналов. Природа. 1995; 374: 363–366. [PubMed] [Google Scholar]
• Pourquie O, Fan CM, Coltey M, Hirsinger E, Watanabe Y, Breant C, Francis-West P, Brickell P, Tessier-Lavigne M, Le Douarin NM. Боковые и осевые сигналы, участвующие в формировании паттерна сомитов птиц: роль BMP4.Клетка. 1996. 84: 461–471. [PubMed] [Google Scholar]
• Рамальо-Сантос М., Мелтон Д.А., МакМахон А.П. Сигналы ежа регулируют множество аспектов развития желудочно-кишечного тракта. Разработка. 2000; 127: 2763–2772. [PubMed] [Google Scholar]
• Решеф Р., Марото М., Лассар А.Б. Регуляция судьбы дорсальных сомитных клеток: BMP и Noggin контролируют время и характер экспрессии миогенного регулятора. Genes & Dev. 1998. 12: 290–303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Riddle RD, Johnson RL, Laufer E, Tabin C.Sonic hedgehog опосредует поляризующую активность ZPA. Клетка. 1993; 75: 1401–1416. [PubMed] [Google Scholar]
• Роббинс Д. Д., Нибаккен К. Э., Кобаяши Р., Сиссон Дж. К., Бишоп Дж. М., Теронд П. П.. Hedgehog вызывает передачу сигнала с помощью большого комплекса, содержащего родственный кинезину белок costal2. Клетка. 1997; 90: 225–234. [PubMed] [Google Scholar]
• Ролинк Х., Портер Дж. А., Чанг К., Танабе Й., Чанг Д. Т., Бичи, Пенсильвания, Джесселл TM. Индукция дна пластинки и мотонейрона с помощью различных концентраций амино-концевого продукта расщепления автопротеолиза Sonic hedgehog.Клетка. 1995. 81: 445–455. [PubMed] [Google Scholar]
• Rudnicki MA, Schnegelsberg PN, Stead RH, Braun T, Arnold HH, Jaenisch R. MyoD или Myf-5 необходимы для формирования скелетных мышц. Клетка. 1993; 75: 1351–1359. [PubMed] [Google Scholar]
• Sasaki H, Hui C, Nakafuku M, Kondoh H. Сайт связывания белков Gli необходим для активности энхансера HNF-3β в донных пластинах трансгенных животных и может отвечать на Shh in vitro. Разработка. 1997; 124: 1313–1322. [PubMed] [Google Scholar]
• Sasaki H, Nishizaki Y, Hui C-C, Nakafuku M, Kondoh H.Регулирование активности Gli2 и Gli3 с помощью амино-концевого домена репрессии: участие Gli2 и Gli3 в качестве первичных медиаторов передачи сигналов Shh. Разработка. 1999; 126: 3915–3924. [PubMed] [Google Scholar]
• Sisson JC, Ho KS, Suyama K, Scott MP. Costal2, новый кинезин-родственный белок в сигнальном пути Hedgehog. Клетка. 1997; 90: 235–245. [PubMed] [Google Scholar]
• Stone DM, Hynes M, Armanini M, Swanson TA, Gu Q, Johnson RL, Scott MP, Pennica D, Goddard A, Phillips H, et al.Патченный ген-супрессор опухолей кодирует кандидатный рецептор для Sonic hedgehog. Природа. 1996. 384: 129–134. [PubMed] [Google Scholar]
• Саммербелл Д., Эшби П.Р., Коутель О., Кокс Д., Йи С.П., Ригби П.В. Экспрессия Myf5 в развивающемся эмбрионе мыши контролируется дискретными и диспергированными энхансерами, специфичными для определенных популяций предшественников скелетных мышц. Разработка. 2000; 127: 3745–3751. [PubMed] [Google Scholar]
• Тайпале Дж., Чен Дж. К., Купер М.К., Ван Б., Манн Р.К., Миленкович Л., Скотт М.П., ​​Бичи, штат Пенсильвания.Эффекты онкогенных мутаций в Smoothened и Patched могут быть отменены циклопамином. Природа. 2000; 406: 1005–1009. [PubMed] [Google Scholar]
• Tajbakhsh S, Bober E, Babinet C, Pournin S, Arnold H, Buckingham M. Ген, нацеленный на локус myf-5 с помощью nlacZ, выявляет экспрессию этого миогенного фактора в зрелых волокнах скелетных мышц, а также ранняя эмбриональная мышца. Dev Dyn. 1996a; 206: 291–300. [PubMed] [Google Scholar]
• Тайбахш С., Роканкур Д., Бэкингем М. Клетки-предшественники мышц, не отвечающие на позиционные сигналы, принимают немиогенные судьбы у мышей с нулевым myf5.Природа. 1996b; 384: 266–270. [PubMed] [Google Scholar]
• Tajbakhsh S, Rocancourt D, Cossu G, Buckingham M. Новое определение генетических иерархий, контролирующих миогенез скелета: Pax-3 и Myf-5 действуют выше MyoD. Клетка. 1997. 89: 127–138. [PubMed] [Google Scholar]
• Tajbakhsh S, Borello U, Vivarelli E, Kelly R, Papkoff J, Duprez D, Buckingham M, Cossu G. Дифференциальная активация Myf5 и MyoD разными Wnts в эксплантатах параксиальной мезодермы мыши и более поздняя активация миогенеза в отсутствие Myf5.Разработка. 1998; 125: 4155–4162. [PubMed] [Google Scholar]
• Тейлор С.М., Джонс, Пенсильвания. Множественные новые фенотипы индуцированы в клетках 10T1 / 2 и 3T3, обработанных 5-азацитидином. Клетка. 1979; 17: 771–779. [PubMed] [Google Scholar]
• Тейе М., Ватанабе Й., Джеффс П., Дюпре Д., Лапойнт Ф., Ле Дуарен Н.М. Sonic hedgehog необходим для выживания как миогенных, так и хондрогенных сомитных клонов. Разработка. 1998; 125: 2019–2030. [PubMed] [Google Scholar]
• van den Heuvel M, Ingham PW.Smoothened кодирует рецептор-подобный серпентиновый белок, необходимый для передачи сигналов hedgehog. Природа. 1996; 382: 547–551. [PubMed] [Google Scholar]
• Фон Олен Т., Лессинг Д., Нусс Р., Хупер Дж. Э. Передача сигналов Hedgehog регулирует транскрипцию через cubitus interruptus, специфичный для последовательности ДНК-связывающий белок. Proc Natl Acad Sci. 1997; 94: 2404–2409. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ван Б., Фаллон Дж. Ф., Бичи, штат Пенсильвания. Hedgehog-регулируемый процессинг Gli3 продуцирует передний / задний градиент репрессоров в развивающихся конечностях позвоночных.Клетка. 2000; 100: 423–434. [PubMed] [Google Scholar]
• Wechsler-Reya RJ, Scott MP. Контроль пролиферации предшественников нейронов в мозжечке с помощью Sonic hedgehog. Нейрон. 1999; 22: 103–114. [PubMed] [Google Scholar]
• Вайнштейн, округ Колумбия, Руис и Альтаба, А. Чен, Худлесс П., Презиозо В.Р., Джессел Т.М., Дарнелл Дж. Фактор транскрипции крылатой спирали HNF-3 β необходим для развития хорды у эмбриона мыши. Клетка. 1994; 78: 575–588. [PubMed] [Google Scholar]
• Цзэн X, Гетц Дж. А., Субер Л. М., Скотт В. Дж., Младший, Шрейнер К. М., Роббинс Д. Д..Свободно диффундирующая форма Sonic hedgehog обеспечивает передачу сигналов на большие расстояния. Природа. 2001; 411: 716–720. [PubMed] [Google Scholar]
• Zhang XM, Ramalho-Santos M, McMahon AP. Сглаженные мутанты обнаруживают повторяющиеся роли для передачи сигналов Shh и Ihh, включая регуляцию L / R асимметрии с помощью узла мыши. Клетка. 2001; 105: 781–792. [PubMed] [Google Scholar]
• Цвайгердт Р., Браун Т., Арнольд Х. Х. Для достоверной экспрессии гена Myf-5 во время миогенеза мышей требуются отдаленные контрольные области: трансгенный подход с использованием искусственных хромосом дрожжей.Dev Biol. 1997; 192: 172–180. [PubMed] [Google Scholar]

Экспрессия shh в сетчатке рыбок данио. На всех панелях показаны конфокальные …

Контекст 1

… точно определить клетки, которые экспрессируют shh в сетчатке рыбок данио, мы сравнили экспрессию в сетчатке shh РНК с новой трансгенной линией, экспрессирующей GFP под контролем shh Promoter (см. Материалы и методы). Мы обнаружили, что и shh РНК, и shh-GFP экспрессируются не только в GCL, но и в проксимальной части INL (рис….

Контекст 2

… далее сравнили экспрессию shh-GFP с Isl1, фактором транскрипции LIM / гомеодомена, который экспрессируется в ряде нейрональных клеток и был обнаружен в GCL и в субпопуляции амакриновых клеток сетчатки грызунов (Thor et al., 1991; Galli-Resta et al., 1997). Мы обнаружили, что с помощью этого подхода можно обнаружить четыре типа RGC: те, которые экспрессируют либо shh-GFP, либо Isl1, те, которые экспрессируют оба, и те, которые не экспрессируют ни один (рис.1G-I). Мы также обнаружили, что амакриновые клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, отличаются от амакриновых клеток, экспрессирующих Isl1 (Рис. …

Контекст 3

… далее сравнили экспрессию shh-GFP с Isl1, LIM Фактор транскрипции гомеодомена, который экспрессируется в ряде нейрональных клеток и был обнаружен в GCL и в субпопуляции амакриновых клеток в сетчатке грызунов (Thor et al., 1991; Galli-Resta et al., 1997). Мы обнаружили, что с помощью этого подхода можно обнаружить четыре типа RGC: те, которые экспрессируют либо shh-GFP, либо Isl1, те, которые экспрессируют оба, и те, которые не экспрессируют ни один (рис.1G-I). Мы также обнаружили, что амакриновые клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, отличаются от амакриновых клеток, экспрессирующих Isl1 (Рис. …

Контекст 4

… далее характеризует клетки, экспрессирующие shh-GFP в сетчатке. , мы сравнили распределение антигена Zn5, который маркирует RGC, с shh-GFP (рис. 1B, C). Клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, демонстрируют типичную морфологию амакриновых клеток (рис. 1C). Мы также обнаруживаем GFP во внутреннем плексиформном слое (IPL) из-за присутствия нейритов из амакриновых клеток, экспрессирующих shh-GFP (рис….

Контекст 5

… дополнительно охарактеризовав клетки, экспрессирующие shh-GFP в сетчатке, мы сравнили распределение антигена Zn5, который маркирует RGC, с shh-GFP (рис. 1B, C). Клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, демонстрируют типичную морфологию амакриновых клеток (рис. 1C). Мы также обнаруживаем GFP во внутреннем плексиформном слое (IPL) из-за присутствия нейритов из амакриновых клеток, экспрессирующих shh-GFP (рис. …

Context 6

… Чтобы дополнительно охарактеризовать клетки, экспрессирующие shh-GFP в сетчатке, мы сравнили распределение антигена Zn5, который маркирует RGC, с shh-GFP (рис. 1B, C). Клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, демонстрируют типичную морфологию амакриновых клеток (рис. 1C). Мы также обнаруживаем GFP во внутреннем плексиформном слое (IPL) из-за присутствия нейритов из амакриновых клеток, экспрессирующих shh-GFP (рис. …

Контекст 7

… сетчатка грызунов, Isl1 экспрессируется как в подмножестве RGC, так и в подмножестве амакриновых клеток в проксимальном INL (Thor et al., 1991; Галли-Реста и др., 1997). Мы находим сходные домены экспрессии Isl1 в сетчатке рыбок данио (Fig. 1D, Fig. 4A). Кроме того, мы также обнаруживаем две отдельные группы Isl1-положительных клеток в дистальном INL через 64 ​​hpf, которые не были описаны ранее, и которые, по-видимому, представляют собой биполярные клетки и горизонтальные клетки (рис. 4A). У shh мутантных эмбрионов мы наблюдаем общее снижение Isl1-позитивных клеток через 64 ​​hpf, и большинство этих клеток обнаруживается в проксимальных отделах сетчатки (Fig. 4B). Количество Isl1-положительных клеток в GCL мутантных эмбрионов shh значительно снижено по сравнению с GCL дикого типа (рис.4A, B), что согласуется с наблюдением, что количество Zn5-позитивных RGCs также сильно снижено у shh мутантных эмбрионов (Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000). Кроме того, другие типы клеток, экспрессирующих Isl1, также сильно редуцированы или отсутствуют, а ламинарная организация клеток, экспрессирующих Isl1, серьезно нарушена у мутантов shh (Рис. …

Sonic Hedgehog, ключевой ген развития, испытавший усиление молекулярная эволюция приматов | Human Molecular Genetics

Аннотация

Sonic Hedgehog ( SHH ) — один из наиболее интенсивно изучаемых генов в биологии развития.Это высококонсервативный ген, встречающийся у таких разнообразных видов, как членистоногие и млекопитающие. У млекопитающего SHH кодирует сигнальную молекулу, которая играет центральную роль в формировании паттерна развития, особенно нервной системы и скелетной системы. Здесь мы показываем, что молекулярная эволюция SHH заметно ускоряется у приматов по сравнению с другими млекопитающими. Мы также показываем, что у приматов ускорение наиболее заметно по линии, ведущей к человеку. Наконец, мы показываем, что ускорение родословной, ведущей к человеку, связано с признаками адаптивной эволюции.В частности, линия, ведущая к человеку, характеризуется безудержным и статистически весьма неслучайным увеличением серинов и треонинов, остатков, которые являются потенциальными субстратами посттрансляционных модификаций. Это указывает на то, что SHH , возможно, развил более сложную посттрансляционную регуляцию в клонах, ведущих к человеку. В совокупности эти результаты предполагают, что SHH является потенциальным участником эволюции специфических для приматов или человека морфологических особенностей нервной и / или скелетной систем и дает импульс для дополнительных исследований, направленных на определение функций, специфичных для приматов или человека. этого ключевого гена развития.

ВВЕДЕНИЕ

Приматы и особенно люди обладают рядом морфологических особенностей, которые отличают их от других видов. Многие из них, такие как увеличенный мозг, прямая осанка, противопоставление большого пальца и уменьшенное лицо, относятся к эволюционным изменениям в нервной системе и скелетной системе. Следовательно, разумно постулировать, что гены развития, участвующие в формировании паттерна нервной и скелетной систем, могли играть важную роль в эволюции фенотипов, специфичных для приматов или человека (1,2).

Ген SHH млекопитающих кодирует сигнальную молекулу, которая играет центральную роль в формировании паттерна развития нервной и скелетной систем (3). В частности, было показано, что SHH играет критическую роль в формировании паттерна головного мозга, спинного мозга, черепно-лицевых элементов, осевого скелета, конечностей и пальцев (3), все это структуры, которые претерпели заметные морфологические изменения в ходе эволюции. приматов, особенно людей.

Во время эмбрионального развития SHH экспрессируется из сильно ограниченного набора клеток в хорде, нервной трубке и зачатках конечностей.Белковый продукт SHH подвергается автокаталитическому расщеплению с образованием N-концевого пептида, известного как SHH-N. Реакция расщепления сочетается с ацилированием жирных кислот на обоих концах пептида. Затем ацилированный SHH-N секретируется из исходных клеток и действует как диффузная сигнальная молекула, которая управляет морфогенезом последующих клеток (4,5). Автокаталитическая активность SHH полностью проявляется в карбоксильной части белка, известной как SHH-C (5). О критической функции этого домена свидетельствует тот факт, что люди, гетерозиготные по мутациям потери функции в SHH-C, страдают голопроэнцефалией, состоянием, характеризующимся сильно уменьшенным размером мозга, слиянием двух полушарий переднего мозга и дефектами черепно-лицевых элементов (6). .Белковая последовательность сигнальной молекулы SHH-N чрезвычайно консервативна у млекопитающих и даже у млекопитающих и членистоногих. Напротив, домен автообработки SHH-C гораздо более различается среди таксонов. В этом исследовании мы исследуем молекулярную эволюцию SHH , фокусируясь на области, кодирующей SHH-C. Мы показываем, что скорость несинонимичных изменений значительно ускоряется у приматов, особенно в родословной, ведущей к человеку. Мы также показываем, что паттерн изменения последовательности согласуется с адаптивной эволюцией.Таким образом, наши данные предполагают, что SHH , возможно, способствовал эволюции специфичных для приматов или человека морфологических особенностей нервной и / или скелетной систем.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Скорость эволюции белковой последовательности в пересчете на скорость нейтральных мутаций обычно оценивается отношением несинонимичных ( K _a ) к синонимичным ( K _s ) скоростей замен.Сначала мы вычислили соотношение K _a / K _s SHH — C у катарринных приматов, сравнив ортологические последовательности между человеком и макакой обезьяны Старого Света (OWM). Затем мы исследовали соотношение K _a / K _s у четырех отрядов млекопитающих, не относящихся к приматам: грызунов (путем сравнения ортологов мышей и крыс), парнокопытных (овец и корова), периссодактилей (зебры и носороги) и хищники (кошка и собака).Мы также исследовали обезьян Нового Света (NWM) (также известных как platyrrhines, который является кладой приматов, более базальной по сравнению с катаррином), сравнивая ортологи белки и совы. Мы обнаружили, что среди этих шести пар видов, K _a / K _s , безусловно, является самым высоким среди приматов катарального типа (рис. 1A). Разница в частоте катаральных инфекций и других млекопитающих статистически высока ( P <0,002 по двустороннему точному критерию Фишера), тогда как различия между другими млекопитающими незначительны.Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что скорость эволюции белковой последовательности SHH-C значительно ускорена у катарринов по сравнению с другими млекопитающими.

Рисунок 1.

Молекулярная эволюция SHH — C у различных млекопитающих. ( A ) Отношения K _a / K _s в шести парных сравнениях. Незакрашенная полоса представляет K _a / K _s между парой видов, указанной под каждой полосой, сплошная полоса представляет K _a / K _s либо ветви человека, либо ветви макаки, ​​поскольку их отклонение от последних предков катарана.( B ) Анализ методом скользящего окна K _a / K _s для тех же шести пар видов.

Рис. 1.

Молекулярная эволюция SHH — C у различных млекопитающих. ( A ) Отношения K _a / K _s в шести парных сравнениях. Незакрашенная полоса представляет K _a / K _s между парой видов, указанной под каждой полосой, сплошная полоса представляет K _a / K _s либо ветви человека, либо ветви макаки, ​​поскольку их отклонение от последних предков катарана.( B ) Анализ методом скользящего окна K _a / K _s для тех же шести пар видов.

Затем мы выполнили анализ в скользящем окне, чтобы выяснить, сосредоточено ли ускорение катарринов в определенных субрегионах гена или оно распределено более равномерно. Этот анализ выявил 5′-подобласть, где K _a / K _s исключительно высока только у катарринов, но близка к фоновому уровню у всех других млекопитающих (рис.1Б). Более того, в этой подобласти catarrhine K _a / K _s превышает 1, что указывает на положительный отбор (7), хотя это само по себе не является окончательным доказательством положительного отбора. Несмотря на высокую скорость эволюции, этот субрегион явно функционально важен для человеческого развития, поскольку миссенс-мутации внутри субрегиона приводят к голопрозэнцефалии (6). Существует также подобласть 3 ‘, которая показывает высокие значения K _a / K _s у большинства видов, что указывает на его высокую изменчивость по таксонам (рис.1Б).

Чтобы выяснить, происходит ли ускорение скорости катарринов преимущественно на человеческой ветви или ветви OWM, мы использовали два вида NWM в качестве внешних групп для назначения нуклеотидных замен человека-OWM на любую из ветвей. Примечательно, что ускорение катарринов почти полностью связано с человеческой ветвью (рис. 1А). Отношение K _a / K _s ветви OWM лишь умеренно выше, чем у некатаринных млекопитающих.Напротив, K _a / K _s человеческой ветви в 4-10 раз больше, чем любой из других исследованных видов, статистически значимое несоответствие ( P <0,001).

Затем мы получили последовательности SHH — C у дополнительных приматов, представляющих ключевые позиции филогении приматов, включая четырех человекообразных обезьян (шимпанзе, горилла, орангутан и гиббон) и прозимиана (лемура) (для выравнивания см. Дополнительные материалы. , Рис.S1). Используя все доступные последовательности приматов, мы построили два филогенетических дерева: одно отображает скорость синонимичных замен (рис. 2A), а другое — скорость несинонимичных изменений (рис. 2B). Мы обнаружили, что скорости синонимичных замен примерно сопоставимы в различных ветвях со скромными уровнями колебаний, хотя ветвь OWM кажется несколько выше, чем другие ветви, что может быть связано с более высокой частотой мутаций в OWM, как сообщалось ранее (8). Напротив, несинонимичные показатели варьируются между ветвями систематическим образом, при этом линия передачи от последних обезьяньих предков к людям показывает значительно больше замен, чем другие ветви.Этот образец отражает продолжающееся ускорение эволюции по линии, ведущей к человеку. Для дальнейшего изучения этого ускорения были выполнены два анализа. Сначала было рассчитано K _a / K _s для каждой ветви филогенетического дерева приматов (рис. 2B). Он показал, что ветви с наивысшими значениями K, _и / K _s располагаются вдоль линии, ведущей к человеку (выделено на рис. 2B). В частности, внутренняя ветвь между последними предками катаринов и последними предками обезьян имеет отношение K _a / K _s , намного большее 1, что предполагает (хотя и не доказывает) положительный отбор.Во-вторых, мы выполнили серию парных сравнений последовательностей, каждая пара состояла из человека и другого приматы. Используя следующего ближайшего приматы в качестве внешней группы, мы назначили замены оснований между человеком и другим приматом на любую эволюционную ветвь. Это показало, что независимо от того, какой примат сравнивался с человеком, K _a / K _s последовательно выше в ветви, ведущей к человеку, чем в ветви, ведущей к другому примату (данные не показаны).В совокупности эти наблюдения показывают, что в пределах филогенетического дерева приматов скорость замены аминокислот SHH-C специфически и резко повышается в линии передачи от последних обезьяньих предков к людям.

Рис. 2.

Молекулярная эволюция SHH — C у приматов. ( A и B ) Филогенетическое дерево, основанное на синонимичных (A) или несинонимичных (B) заменах, с горизонтальным расстоянием, представляющим количество замен, скорректированных на множественные совпадения и смещение перехода / трансверсии.В (B) соотношение K _и / K _s указано над каждой ветвью, а линия, ведущая к людям (то есть от последних обезьяньих предков до людей), выделена жирным шрифтом. ( C ) Безудержное увеличение серинов / треонинов в линии, ведущей к человеку. Прирост (+) или потеря (-) серинов (S) или треонинов (T) указаны над каждой ветвью. Длины ответвлений показаны произвольно.

Рис. 2.

Молекулярная эволюция SHH — C у приматов.( A и B ) Филогенетическое дерево, основанное на синонимичных (A) или несинонимичных (B) заменах, с горизонтальным расстоянием, представляющим количество замен, скорректированных на множественные совпадения и смещение перехода / трансверсии. В (B) соотношение K _и / K _s указано над каждой ветвью, а линия, ведущая к людям (то есть от последних обезьяньих предков до людей), выделена жирным шрифтом. ( C ) Безудержное увеличение серинов / треонинов в линии, ведущей к человеку.Прирост (+) или потеря (-) серинов (S) или треонинов (T) указаны над каждой ветвью. Длины ответвлений показаны произвольно.

Безудержное и статистически весьма неслучайное увеличение серинов / треонинов в линии, ведущей к человеку

Классический и наиболее часто используемый метод обнаружения положительного отбора — проверить, превышает ли скорость аминокислотных изменений в гене нейтральное ожидание. Другой подход состоит в том, чтобы спросить, являются ли типы аминокислотных замен в высшей степени неслучайными по сравнению с нейтральным ожиданием (9).С этой целью мы проверили все замены аминокислот в SHH-C, которые произошли у приматов. Удивительно, но среди 13 замен между последними обезьяньими предками и современными людьми восемь привели к добавлению серинов или треонинов, остатков, которые являются потенциальными субстратами ковалентных посттрансляционных модификаций (обсуждаемых ниже), но ни один из них не привел к потере серина или треонин (рис. 2С).

Это наблюдение кажется в высшей степени неслучайным. Чтобы оценить его количественно, мы провели два статистических анализа.Во-первых, мы предположили модель, в которой несинонимичные изменения в SHH — C считаются выборочно нейтральными; Затем мы рассчитали вероятность того, что 13 несинонимичных замен в гене приведут к увеличению количества серинов / треонинов на восемь или более (см. «Материалы и методы»). Этот анализ показал, что наблюдаемое увеличение серинов / треонинов является значительным отклонением от нейтрального ожидания ( P <0,0001). Во втором анализе мы сравнили SHH-C с эмпирическими данными.В линии от последних предков катарана до человека имеется 10 замен аминокислот, что приводит к увеличению количества серинов / треонинов на шесть. Учитывая доступность полногеномных последовательностей человека, макака и мыши, мы смогли изучить усиление или потерю серинов / треонинов для большого количества генов в линии от последних предков катаррина до человека. Используя 2939 генов, которые содержали по крайней мере шесть аминокислотных замен в указанной линии, мы получили эмпирическое распределение скоростей, с которыми гены набирали или теряли серины / треонины (рис.3). SHH-C является явным выбросом в этом распределении ( P <0,001), демонстрируя, что его безудержное увеличение серинов / треонинов в высшей степени неслучайно даже по сравнению с эмпирическими данными. Мы также отмечаем, что единственными другими ветвями приматов на рис. 2C, для которых SHH-C приобрел или потерял какие-либо серины / треонины, являются ветвь OWM (приобретающая один серин и один треонин, но теряющая два серина в других положениях) и ветвь NWM. (получение одного серина). Кроме того, ни одна из замен аминокислот в SHH-C между двумя видами NWM, использованными в этом исследовании (т.е. беличья обезьяна и сова) включает серин или треонин (данные не показаны). Таким образом, безудержное увеличение серинов / треонинов является отличительной чертой эволюции SHH-C в линии приматов, ведущей к человеку. Значительное отклонение этого открытия от нейтрального ожидания и эмпирических наблюдений за другими генами дает убедительный аргумент в пользу того, что положительный отбор ответственен за увеличение серинов / треонинов.

Рисунок 3.

Скорость увеличения или потери серинов / треонинов в 2939 генах. Уровень каждого гена рассчитывается как количество чистого прироста (+) или чистой потери (-) серинов / треонинов в линии от последних предков катарана до человека, деленное на общее количество замен аминокислот в этой линии. Гены объединяются в соответствии с их ставками. Средняя скорость каждого интервала указывается на оси x , а диапазон каждого интервала — от медианы минус 0,05 (включительно) до медианы плюс 0.05 (эксклюзив).

Рисунок 3.

Скорость увеличения или потери серинов / треонинов в 2939 генах. Уровень каждого гена рассчитывается как количество чистого прироста (+) или чистой потери (-) серинов / треонинов в линии от последних предков катарана до человека, деленное на общее количество замен аминокислот в этой линии. Гены объединяются в соответствии с их ставками. Средняя скорость каждого интервала указывается на оси x , а диапазон каждого интервала — от медианы минус 0.От 05 (включительно) до медианы плюс 0,05 (без учета).

Гликозилирование и фосфорилирование серинов или треонинов — хорошо зарекомендовавшие себя средства посттрансляционной регуляции (10,11). Вычислительный анализ восьми серинов и треонинов, добавленных в линию от последних обезьяньих предков к человеку, предполагает, что четыре являются потенциальными сайтами гликозилирования, а три — потенциальными сайтами фосфорилирования (дополнительный материал, рис. S1). Учитывая, что SHH является секретируемым белком, гликозилирование может быть более вероятным из двух возможных (10).Мы отмечаем, что SHH-C у мышей и кур действительно подвергается гликозилированию (12). Кроме того, трехмерная структура in silico , сконструированная для частичного полипептида SHH-C человека, показала, что сайты добавлений серина / треонина появляются в областях, стерически доступных для потенциальных модификаций (данные не показаны). Наконец, мы отмечаем, что точечная мутация человека, которая, как известно, нарушает функцию SHH и вызывает голопроэнцефалию, располагается непосредственно перед добавленным серином (6), и что мутация, по прогнозам, нарушает гликозилирование этого серина (дополнительный материал, рис.S1). Эти наблюдения подтверждают возможность того, что SHH развил более сложные посттрансляционные модификации в линии, ведущей к человеку.

Полиморфизм человека по локусу

Одним из признаков недавнего положительного отбора является подавленный полиморфизм с избытком редких аллелей в пораженном локусе (13). Чтобы оценить, демонстрирует ли SHH такую ​​сигнатуру, мы секвенировали область размером 25 т.п.н., охватывающую ген, в панели из 42 человек (84 хромосомы) из различных популяций.Гетерозиготность ( π ) транскрибируемой области размером 10 т.п.н. SHH составляет 0,0004 (0,0005, если исключить кодирующую последовательность), что намного ниже, чем в среднем по геному 0,0008–0,001 (14–17). Таджима D той же области составляет -0,9 (-0,7, если кодирующая последовательность исключена). Отрицательный показатель D Таджимы указывает на избыток редких аллелей относительно нейтрального ожидания и, аналогичный низкой гетерозиготности, также является признаком недавнего положительного отбора (18). Таким образом, значения как гетерозиготности, так и значения D Tajima в транскрибируемой области SHH наводят на мысль о положительном отборе этого гена во время недавней эволюции человека.Чтобы исследовать эту возможность в дальнейшем, мы выполнили анализ скользящего окна на гетерозиготность и D Tajima вдоль области 25 kb, окружающей локус SHH (Рис. 4). Мы обнаружили две области особенно выраженной депрессии для обоих этих параметров: одна соответствует экзону 3, который кодирует весь SHH-C, а другая — интрону 1, который содержит важные энхансерные элементы (19). Эти депрессии являются выбросами по сравнению с набором нейтрально эволюционирующих областей генома, недавно исследованных на популяционной панели, сопоставимой с нашей (16) (рис.4). Хотя эти депрессии не обеспечивают окончательного доказательства положительного отбора в свете сложной демографической истории людей (20), они, тем не менее, наводят на мысль о недавних избирательных ударах, которые возникли в результате положительного отбора, действующего в локусе SHH (13).

Фигура 4. Профиль полиморфизма

области 21 т.п.н., охватывающей локус SHH человека. На верхней панели изображена геномная структура SHH .На следующих трех панелях в порядке убывания изображены анализы в скользящем окне сохранения последовательности между человеком и мышью, гетерозиготности ( π ) у людей и D Таджимы у людей. Низкое значение π указывает на низкий уровень полиморфизма, тогда как низкое значение D Tajima указывает на избыток редких аллелей. Толстые сплошные линии и пунктирные линии на двух нижних панелях изображают среднее и стандартное отклонение, соответственно, для недавно изученного набора нейтрально развивающихся геномных областей размером 2–3 т.п.н. (16).Кодирующие части экзонов выделены.

Фигура 4.

Профиль полиморфизма области 21 т.п.н., охватывающей локус SHH человека. На верхней панели изображена геномная структура SHH . На следующих трех панелях в порядке убывания изображены анализы в скользящем окне сохранения последовательности между человеком и мышью, гетерозиготности ( π ) у людей и D Таджимы у людей. Низкое значение π указывает на низкий уровень полиморфизма, тогда как низкое значение D Tajima указывает на избыток редких аллелей.Толстые сплошные линии и пунктирные линии на двух нижних панелях изображают среднее и стандартное отклонение, соответственно, для недавно изученного набора нейтрально развивающихся геномных областей размером 2–3 т.п.н. (16). Кодирующие части экзонов выделены.

Молекулярная эволюция других представителей семейства

SHH — один из трех генов семейства Hedgehog млекопитающих. Два других — это Indian Hedgehog ( IHH ) и Desert Hedgehog ( DHH ).Мы получили последовательности IHH и DHH у человека, макака, мыши, крысы и нескольких других видов приматов и неприматов. Мы обнаружили, что эти два гена высоко консервативны у этих различных видов (данные не показаны). Таким образом, ускоренная эволюция SHH в линии приматов, ведущей к человеку, по-видимому, является отличительной чертой этого члена семейства Hedgehog .

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы показали, что молекулярная эволюция ключевого гена развития SHH (более конкретно, его домена автообработки) резко ускоряется у приматов по сравнению с другими млекопитающими.У приматов ускорение наиболее заметно по линии, ведущей к человеку. Особенно поразительным является наблюдение, что линия, ведущая к человеку, характеризуется безудержным и статистически весьма неслучайным увеличением серинов и треонинов. Наконец, определенные особенности полиморфизма в локусе SHH у людей, такие как депрессивная гетерозиготность и D Tajima, согласуются с сигнатурами недавних положительных выборочных обследований.

Мы утверждаем, что в совокупности эти наблюдения указывают на положительный отбор, а не на ослабление функциональных ограничений, по следующим причинам.Во-первых, потеря одной функциональной копии SHH у человека приводит к глубоким аномалиям развития мозга и черепно-лицевых элементов (6). Для сравнения, потеря одной копии SHH у мышей не имеет детектируемого фенотипа (21). Эти наблюдения согласуются с критической важностью SHH для развития человека и не поддерживают функциональное расслабление. Во-вторых, как показано на рисунке 1C, более высокая скорость эволюции SHH у приматов в значительной степени связана с локальным увеличением скорости в небольшой подобласти гена, где K _a / K _s превышает 1 у приматов, но очень низкий у всех других исследованных млекопитающих.Это выступает против ослабления ограничений в масштабах всего гена и вместо этого предполагает адаптивную эволюцию в этом субрегионе. Функциональная важность этого субрегиона для человеческого развития дополнительно подтверждается тем фактом, что миссенс-мутации в этом субрегионе приводят к голопрозэнцефалии (6). В-третьих, большинство замен аминокислот по линии приматов, ведущих к человеку, приводит к добавлению серинов или треонинов, остатков, которые потенциально могут быть модифицированы гликозилированием или фосфорилированием.Статистический тест показал, что такой резкий рост серинов и треонинов является значительным отклонением от нейтральных ожиданий; это также выброс по сравнению с эмпирическими данными, собранными на большом количестве генов в геноме. В высшей степени неслучайный характер этого шаблона замены аминокислот явно несовместим с ослабленным ограничением (что должно привести к гораздо более случайному шаблону замены) и вместо этого поддерживает функциональное значение этих замен.Резкое увеличение количества серинов / треонинов в SHH-C в эволюционной линии, ведущей к человеку, предполагает, что SHH-C человека может подвергаться более сложным посттрансляционным модификациям, которые, в свою очередь, могут привести к более сложной регуляции SHH- Производство N. Интересно, что замены серина / треонина в гомеотическом гене Ubx , как недавно было показано, имеют решающее значение для эволюционной модификации строения тела насекомых (22). Наконец, паттерны полиморфизма человеческого локуса SHH наводят на мысль о недавних положительных селективных сканированиях в этом локусе.В совокупности эти многочисленные доказательства убедительно доказывают, что SHH претерпел адаптивную эволюцию в линии приматов, ведущей к человеку.

SHH центрально участвует в формировании паттерна множества тканей, в первую очередь нервной системы (включая головной и спинной мозг) и скелетной системы (включая черепно-лицевые элементы, осевой скелет, конечности и пальцы) (3). Его ускоренные и весьма необычные паттерны молекулярной эволюции в линии, ведущей к человеку, могут поэтому иметь отношение к появлению определенных специфических для приматов или человека особенностей в нервной и / или скелетной системах, что потенциально может быть проверено в будущих исследованиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор и анализ последовательности

Геномная ДНК была получена от следующих видов: обыкновенного шимпанзе ( Pan troglodytes ), низинной гориллы ( Gorilla gorilla ), орангутанга ( Pongo pygmaeus ), белорукого гиббона ( Hylobates lar ), крабоеда. макака ( Macaca fascicularis ) *, боливийская обезьяна-белка ( Saimiri boliviensis ) *, обезьяна-сова ( Aotus spp .) *, черно-белый лемур ( Varecia variegata variegata ) *, овца ( Ovis aries ) *, корова ( Bos taurus ) *, домашняя кошка ( Felis cattus ) *, домашняя собака ( Canis фамильяр ) *, зебра Гранта (Equus burchelli boehmi ) * и северный белый носорог ( Ceratotherium simum cottoni ) *. Тотальную РНК также экстрагировали из образцов мозга, если они были доступны (обозначены звездочками), и примировали случайными гексамерами или поли (Т) олигомерами для синтеза кДНК первой цепи.Стандартные условия ПЦР использовали для амплификации SHH из геномной ДНК (100–500 нг на 30 мкг реакции) и кДНК (0,5–5 нг на реакцию). Праймеры для ПЦР изначально были основаны на человеческой последовательности SHH до получения видоспецифической последовательности. Все секвенирование проводили с использованием стандартной химии терминатора красителя для продуктов ПЦР. SHH последовательности человека ( Homo sapiens ; инвентарный номер GenBank), мыши ( Mus musculus ; инвентарный номер GenBank) и крысы ( Rattus norvegicus ; инвентарный номер GenBank).) были получены из баз данных NCBI. Нуклеотидные последовательности выравнивали в рамке считывания с использованием программы Megalign в пакете программ DNASTAR (DNASTAR, Мэдисон, Висконсин, США). При многовидовом выравнивании предковая последовательность была выведена с использованием экономичности. Функция Diverge из пакета Wisconsin Package v10.2 (Accelrys Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) использовалась для анализа эволюционного расхождения (т. Е. Количества синонимичных и несинонимичных замен и K _a и K _s оценок) по методу Ли (23).Аналогичные результаты были получены с использованием метода PAML (24). Для анализа скользящего окна K _a / K _s , K _a был рассчитан для размера окна 90 и шага скольжения трех пар оснований, и K _s из весь регион использовался в качестве знаменателя, чтобы избежать проблем, связанных со стохастической вариацией, которая иногда приводит к делению на ноль.

Статистический анализ

Для оценки статистической значимости того, что соотношение K _a / K _s одной линии отличается от соотношения другой линии, количество синонимичных и несинонимичных замен скорректировано на множественные совпадения и переход / трансверсию систематическая ошибка была рассчитана для обеих линий с использованием метода Ли (23), реализованного в пакете Wisconsin Package v10.2. Полученные четыре значения были помещены в таблицу сопряженности 2 × 2 и оценены на предмет статистической значимости с помощью двустороннего точного критерия Фишера.

Прогнозирование функциональных сайтов

Вероятные сайты гликозилирования и фосфорилирования были идентифицированы механизмами онлайн-прогнозирования на http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc и http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos, соответственно, на основе нейронных сетевые алгоритмы, как описано ранее (25,26).

Анализ полиморфизма человека

Смежная двухцепочечная последовательность была получена от 42 человек (84 хромосомных копии) размером 25 т.п.н. с центром вокруг локуса SHH на хромосоме 7q36 человека.3. Эти люди были выбраны из панелей по изменчивости человека Кориелла, чтобы представить разнообразный выбор мирового населения (шесть североафриканцев, шесть южноафриканцев, шесть китайцев, шесть русских, три баска, три иберийца, три островитянина с островов Тихого океана, три выходца из Анд, три выходца из Юго-Восточной Азии и три выходца из Юго-Западной Азии). Хроматограммы последовательностей получали с помощью секвенатора ABI 3700 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) и выравнивали с помощью программного обеспечения Sequencher (Gene Codes Corporation, Анн-Арбор, Мичиган, США).Полиморфизм был обнаружен прямым анализом хроматограмм последовательностей, отображаемых Sequencher. Анализ в скользящем окне нуклеотидного разнообразия ( π ) и Tajima’s D был проведен с использованием программного обеспечения DNAsp (27) с размером окна 2500 п.н. и скользящим шагом 50 п.н. Этот размер окна был выбран для совместимости с предыдущим исследованием полиморфизма человека (16), которое использовалось в этом исследовании в качестве справочного материала. Аналогичные результаты были получены с размером окна 1000 или 2000 п.н.Анализ консервации последовательностей между человеком и мышью в скользящем окне был выполнен с помощью программного обеспечения VISTA (28) с размером окна 200 п.н. и скользящим шагом 100 п.н.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Дополнительные материалы доступны в HMG Online.

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

Секвенирование генома шимпанзе: понимание эволюции человека и болезней

Nat.Преподобный Жене.

2003

4

20

28

Генетические связи между развитием мозга и эволюцией мозга

Nat. Преподобный Жене.

2005

6

581

590

Передача сигналов Hedgehog в развитии животных: парадигмы и принципы

Genes Dev.

2001

15

3059

3087

Автопротеолиз в биогенезе белков ежа

Science

1994

266

1528

1537

Активность формирования паттерна Hedgehog: роль липофильной модификации, опосредованной карбоксиконцевым доменом автопроцессинга

Cell

1996

86

21

34

Мутационный спектр гена sonic hedgehog при голопрозэнцефалии: мутации SHH вызывают значительную долю аутосомно-доминантной голопрозэнцефалии

Hum.Мол. Genet.

1999

8

2479

2488

Molecular Evolution

1997

Сандерленд, Массачусетс

Sinauer Associates

Медленные молекулярные часы у обезьян, обезьян и людей Старого Света

Мол. Биол. Evol.

2002

19

2191

2198

Адаптивная диверсификация в большом семействе недавно дублированных, плацентарно экспрессируемых генов

Proc.Natl Acad. Sci. США

2000

97

3319

3323

Essentials of Glycobiology

1999

Cold Spring Harbor, New York

Cold Spring Harbor Laboratory Press

Peptides and Protein Phosphorylation

1990

Boca Raton, Florida

12 CRC Press ,.

Протеолитический процессинг дает две секретируемые формы sonic hedgehog

Mol.Клетка. Биол.

1995

15

2294

2303

Сигнатуры естественного отбора в геноме человека

Nat. Преподобный Жене.

2003

4

99

111

Низкое нуклеотидное разнообразие у человека

Genetics

1991

129

513

523

Карта вариации последовательности генома человека, содержащая 1.42 миллиона однонуклеотидных полиморфизмов

Nature

2001

409

928

933

Конверсия гена и разные истории популяций могут объяснить контраст между полиморфизмом и уровнями неравновесия по сцеплению

Am. J. Hum. Genet.

2001

69

831

843

Вариация последовательности генома человека и влияние истории генов, мутации и рекомбинации

Nat.Genet.

2002

32

135

142

Статистический метод проверки гипотезы нейтральной мутации по полиморфизму ДНК

Genetics

1989

123

585

595

Сравнительный анализ генов Shh позвоночных выявил новую консервативную некодирующую последовательность

Mamm. Геном

2003

14

192

201

Доказательства роста популяции людей искажены мелкомасштабной популяционной структурой

Trends Genet.

2002

18

559

563

Важная роль Sonic hedgehog в морфогенезе волосяных фолликулов

Dev. Биол.

1999

205

1

9

Мутация белка Hox и макроэволюция тела насекомых plan

Nature

2002

415

914

917

Беспристрастная оценка частоты синонимичных и несинонимичных замен

J. Mol. Evol.

1993

36

96

99

PAML: программный пакет для филогенетического анализа максимального правдоподобия

Comput. Прил. Biosci.

1997

13

555

556

NetOglyc: прогнозирование сайтов O-гликозилирования муцинового типа на основе контекста последовательности и поверхностной доступности

Glycoconj.J.

1998

15

115

130

Прогнозирование сайтов фосфорилирования эукариотических белков на основе последовательностей и структур

J. Mol. Биол.

1999

294

1351

1362

DnaSP версия 3: интегрированная программа для молекулярной популяционной генетики и анализа молекулярной эволюции

Bioinformatics

1999

15

174

175

VISTA: визуализация глобального выравнивания последовательностей ДНК произвольной длины

Bioinformatics

2000

16

1046

1047

© Автор, 2006. Опубликовано Oxford University Press. Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: [email protected]

Sonic Hedgehog — новый канальцевый фактор роста интерстициальных фибробластов после повреждения почек

Abstract

Трубчатый эпителий составляет большую часть паренхимы почек и является основной мишенью для различных повреждений почек.Однако то, как поврежденные канальцы управляют активацией и пролиферацией интерстициальных фибробластов, остается малоизученным. Здесь мы исследовали роль sonic hedgehog (Shh), секретируемого внеклеточного сигнального белка, в пролиферации фибробластов. Shh индуцировался в эпителии почечных канальцев на животных моделях ХБП, индуцированных ишемией / реперфузионным повреждением (IRI), адриамицином или удалением почечных масс, а также в почечных канальцах биоптатов почек от пациентов с ХБП с различной этиологией. Используя репортерных мышей Gli1-CreER ^T2 , мы идентифицировали интерстициальные фибробласты как основные мишени передачи сигналов Shh почек in vivo . In vitro , инкубация с Shh способствовала нормальной пролиферации фибробластов почек крысы, которую оценивали с помощью подсчета клеток, анализа MTT и анализа включения BrdU, и стимулировала индукцию многочисленных генов, связанных с пролиферацией. Однако Shh не влиял на пролиферацию эпителиальных клеток почечных канальцев. In vivo сверхэкспрессия Shh способствовала размножению фибробластов и усугубляла фиброзные поражения почек после IRI. Соответственно, блокада передачи сигналов Shh циклопамином, низкомолекулярным ингибитором Smoothened, ингибировала пролиферацию фибробластов, уменьшала накопление миофибробластов и ослабляла почечный фиброз.Эти исследования идентифицируют Shh как новый, специфический и мощный фактор роста канальцев, который способствует пролиферации и активации интерстициальных фибробластов. Наши данные также предполагают, что блокада передачи сигналов Shh является вероятной стратегией терапевтического вмешательства при почечном фиброзе.

Фиброз почек, конечный общий результат широкого спектра ХЗП, характеризуется активацией продуцирующего матрикс, α -позитивного миофибробласта гладких мышц ( α -SMA), непрерывной выработкой и отложением внеклеточных матрикс и прогрессирующее образование фиброзного рубца. ^1–3 Хотя миофибробласты могут происходить из разных источников, таких как костный мозг, эндотелий и канальцевый эпителий, локальная пролиферация резидентных фибробластов остается основным путем, ведущим к активации и разрастанию популяции миофибробластов в пораженных почках. ^4–6 В этом контексте идентификация ключевых медиаторов, которые контролируют пролиферацию почечных фибробластов и определение основных механизмов, будет иметь важное значение для раскрытия патогенного механизма почечного фиброза и разработки рациональных стратегий вмешательства. ⁷

В нормальных почках взрослого человека канальцевый эпителий составляет основную часть паренхимы почек. Обширные исследования показали, что клетки канальцев особенно уязвимы для широкого спектра метаболических, иммунологических, ишемических и токсических поражений, и в большинстве случаев они являются основной мишенью для различных повреждений почек. ^8–11 Эти наблюдения предполагают, что повреждение канальцев часто является ранним и центральным событием, которое запускает расширение фибробластов и интерстициальный фиброз. ^10,12,13 Однако, как именно поврежденные канальцы управляют пролиферацией и активацией фибробластов в соседнем интерстиции, остается плохо изученным. Одна правдоподобная гипотеза заключается в том, что поврежденные канальцы продуцируют и секретируют внеклеточные сигнальные белки, которые паракринным образом определяют пролиферацию фибробластов. Однако идентичность такого митогенного фактора, происходящего из канальцев, для интерстициальных фибробластов остается в значительной степени неуловимой.

Sonic hedgehog (Shh), наиболее изученный член лигандов сигнального пути hedgehog, представляет собой секретируемый внеклеточный сигнальный белок, который играет фундаментальную роль в регуляции ряда процессов развития в органогенезе млекопитающих. ^14,15 Во время развития почек Shh контролирует экспрессию иерархии генов, участвующих в формировании тканевого паттерна и регуляции клеточного цикла. ^16–19 Соответственно, мутации в гене Shh были связаны с дефектами развития почек, что привело к гипоплазии почек у мышей. ^20,21 В нормальных почках взрослого человека уровень экспрессии Shh чрезвычайно низок и практически не обнаруживается. ²² Вопрос о том, изменяется ли экспрессия Shh в пораженных почках, остается спорным.Хотя мы сообщаем, что Shh индуцируется специфически в эпителии почечных канальцев при обструктивной нефропатии после односторонней обструкции мочеточника (UUO), ²² другое исследование показывает, что он не изменяется во время UUO. ²³ Тем не менее, фактор транскрипции Gli1, прямая нижестоящая мишень и репортер активной передачи сигналов hedgehog, специфически индуцируется в почечных интерстициальных фибробластах фиброзных почек. ^22,23 Мы ранее предположили, что происходящий из канальцев Shh обеспечивает эпителиально-мезенхимальную коммуникацию (EMC) путем избирательного воздействия на интерстициальные фибробласты, приводя к их миофибробластическому переходу. ²² Однако остается неизвестным, действует ли Shh также как митоген и регулирует пролиферацию фибробластов, которая может приводить к увеличению популяции клеток, продуцирующих матрикс.

В этом исследовании мы исследовали регуляцию Shh на трех моделях фиброзных заболеваний почек, а также на биопсиях почек человека от пациентов с ХЗП. Наши результаты показывают, что повышающая регуляция Shh является частым явлением при CKD и что Shh избирательно способствует пролиферации фибробластов in vitro .Мы также показали, что избыточная экспрессия Shh или блокада его передачи сигналов с помощью низкомолекулярного ингибитора оказывает драматическое влияние на тяжесть почечного фиброза после повреждения почек in vivo . Эти результаты подтверждают, что происходящий из канальцев Shh является индуцибельным, специфическим и мощным митогеном фибробластов, который контролирует пролиферацию почечных фибробластов и фиброз почек.

Результаты

Тубулярная индукция Shh является частым обнаружением в различных моделях ХБП

Для изучения регуляции Shh после повреждения почек мы изучили три модели ХБП на животных, индуцированных ишемией / реперфузией почек, адриамицином (ADR) или субтотальным почечным массовая абляция.Эти модели хорошо зарекомендовали себя и широко используются, и они представляют различную этиологию, приводящую к фиброзу почек. ^9,24–27 Как показано на рисунке 1A, количественный анализ RT-PCR в реальном времени (qRT-PCR) показал, что мРНК Shh почек заметно индуцировалась через 10 дней после ишемии / реперфузионного повреждения (IRI) по сравнению с фиктивным контролем. Соответственно, белок Shh также значительно индуцировался в поврежденных почках после IRI, что было показано вестерн-блоттингом лизатов цельной почки (рис. 1, B и C).Точно так же уровни мРНК Shh в почках (рис. 1E) и белка (рис. 1, F и G) были значительно повышены через 5 недель после введения ADR.

Индукция Shh — частая находка в моделях на животных с ХЗП. (A) анализы qRT-PCR показывают значительную индукцию экспрессии мРНК Shh в фиброзных почках после почечного IRI в течение 10 дней. * P <0,05 по сравнению с фиктивным контролем ( n = 4–5). (B и C) Вестерн-блоттинг почечной экспрессии белка Shh в ложных и поврежденных почках через 10 дней после IRI.Представлены репрезентативные (B) Вестерн-блоттинг и (C) количественные данные. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. * P <0,05 по сравнению с фиктивным контролем ( n = 4–5). (D) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание показывает повышенную экспрессию Shh в мышиных моделях IRI (10 дней) и нефропатии ADR (5 недель). На нижней панели увеличены заштрихованные области. Стрелки указывают на Shh-положительные канальцы. (E) Экспрессия мРНК Shh в почках при нефропатии ADR. Экспрессию мРНК Shh оценивали в почках через 5 недель после инъекции ADR.* P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 5). (F и G) Вестерн-блоттинг почечного белка Shh через 5 недель после инъекции ADR. Представлены репрезентативные (F) Вестерн-блоттинг и (G) количественные данные. Цифры (1–5) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 5). (H и I) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание показало индукцию белка Shh в модели остаточной почки крысы после нефрэктомии 5/6 через 12 недель. Масштабная линейка, 50 µ м.(J) Идентификация интерстициальных фибробластов как hedgehog-реагирующих клеток в фиброзных почках. Трансгенных мышей Gli1-CreER ^T2 подвергали IRI в течение 10 дней, а почки подвергали двойному иммуноокрашиванию на рекомбиназу Cre (красный) и различные маркеры, специфичные для типа клеток (зеленый). Стрелки, CD45- или CD31-положительные клетки; стрелки, Cre-позитивные клетки; широкие стрелки — клетки с положительным окрашиванием как на вементин, так и на Cre. Масштабная линейка, 20 µ м. (K) Диаграмма показывает, что Shh из канальцев специфически нацеливается на интерстициальные фибробласты после повреждения почек.GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол.

Далее мы исследовали экспрессию и локализацию белка Shh в фиброзных почках на различных моделях ХЗП. Как показано на Фигуре 1D, иммуногистохимическое окрашивание специфическим антителом показало, что в ложнооперированных контрольных почках обнаруживается небольшое количество белка Shh или его отсутствие. Однако заметная индукция белка Shh была четко очевидна в фиброзных почках после повреждения IRI или ADR. Белок Shh преимущественно локализовался в эпителии почечных канальцев (рис. 1D, стрелки), тогда как интерстициальные клетки в увеличенном интерстиции были в основном отрицательными для окрашивания Shh.Следует отметить, что окрашивание Shh не происходило в присутствии антигена Shh, что указывает на специфичность этого окрашивания (дополнительный рисунок 1). Точно так же на модели остаточной почки крысы почечный белок Shh резко индуцировался через 12 недель после нефрэктомии 5/6 по сравнению с фиктивным контролем (рис. 1, H и I). Эти результаты позволяют предположить, что индукция Shh, специфическая для канальцев, является частой находкой в ​​различных моделях ХБП на животных.

Tubule-Derived Shh нацелена на интерстициальные фибробласты

Более ранние исследования идентифицировали почечные интерстициальные фибробласты как клетки, отвечающие за «еж» в фиброзных почках. ^22,23 Для дальнейшего решения этой проблемы мы использовали трансгенных мышей Gli1-CreER ^T2 , у которых слитый белок Cre-ERT2, состоящий из рекомбиназы Cre и мутантного рецептора эстрогена, находится под контролем эндогенных элементов промотора / энхансера Gli1. . По существу, Cre экспрессируется исключительно в Gli1-экспрессирующих клетках, тем самым указывая на клетки-мишени передачи сигналов hedgehog у этих мышей. ^28,29 Мы обнаружили, что через 10 дней после IRI Cre экспрессировался в почечных интерстициальных клетках, но не в канальцевых клетках.Двойное иммуноокрашивание показало, что Cre (рис. 1J, красный) был окрашен виментином (маркер фибробластов) (рис. 1J, зеленый), но не CD45 (общий маркер лейкоцитов) или CD31 (маркер эндотелиальных клеток) (рис. 1J). Следовательно, как показано на рисунке 1K, эти результаты предполагают, что происходящий из канальцев Shh специфически нацелен на интерстициальные фибробласты в пораженных почках.

Повышенная экспрессия Shh в почечных канальцах ХБП человека

Чтобы установить клиническую значимость регуляции Shh для патогенеза ХБП человека, мы исследовали его экспрессию в образцах биопсии почек от пациентов с различными ХБП.Как показано на рисунке 2, белок Shh практически не обнаруживается в нормальных почках человека (проверено два случая). Однако белок Shh был заметно индуцирован во всех 10 образцах биопсии от пациентов с ХБП, что было показано иммуногистохимическим окрашиванием. Диагноз и демографические данные пациентов представлены в дополнительной таблице 1. На рис. 2 представлены репрезентативные микрофотографии окрашивания Shh в срезах почек пациентов с IgA-нефропатией, мембранозным нефритом и ФСГС. Белок Shh преимущественно локализовался в эпителии почечных канальцев больных почек человека (рис. 2, стрелки).Иногда жидкости в просвете почечных канальцев также окрашиваются положительно на Shh, что позволяет предположить, что он может секретироваться канальцевыми клетками. Помимо канальцевых клеток, некоторые клубочковые подоциты также были положительными по окрашиванию Shh (данные не показаны). Однако почечные интерстициальные клетки были практически отрицательными для окрашивания Shh. Эти данные указывают на то, что Shh является индуцибельным секретируемым фактором, происходящим из канальцев, который может играть роль в патогенезе ХЗП человека.

Shh индуцируется специфически в эпителии почечных канальцев при ХЗП человека.Образцы биопсии почек человека иммуногистохимически окрашивали специфическими антителами против белка Shh. Типичные микрофотографии показывают экспрессию и локализацию белка Shh при ХЗП человека. Неопухолевую ткань почек пациентов с почечно-клеточным раком, перенесших нефрэктомию, использовали в качестве нормального контроля. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Стрелки указывают на Shh-положительные канальцы. Масштабная линейка, 50 мкм м.

Shh избирательно способствует пролиферации почечных фибробластов

Поскольку интерстициальные фибробласты являются основными мишенями Shh, происходящего из канальцев, в фиброзных почках (рис. 1J), мы затем исследовали его потенциальное действие в почечных интерстициальных фибробластах in vitro .С этой целью нормальные интерстициальные фибробласты почек крысы (NRK-49F) инкубировали с различными концентрациями рекомбинантного человеческого белка Shh в течение различных периодов времени, как указано. Заметное увеличение плотности клеток NRK-49F наблюдалось после обработки Shh, что проиллюстрировано на фазово-контрастных изображениях на Фигуре 3A. Подсчет клеток показал, что Shh существенно увеличивает количество клеток NRK-49F в зависимости от дозы (рис. 3B) и времени (рис. 3C), что позволяет предположить, что Shh действует как мощный митоген, который способствует пролиферации почечных фибробластов.Аналогичные результаты были получены при использовании количественного колориметрического анализа [3-4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (рис. 3D). Мы также оценили способность Shh стимулировать почечные фибробласты, входящие в клеточный цикл и подвергающиеся синтезу ДНК, что отражалось включением бромдезоксиуридина (BrdU). Как показано на фиг. 3, E и F, повышенное включение BrdU наблюдалось в клетках NRK-49F после инкубации с Shh в течение 48 часов по сравнению с контролями. Как и ожидалось, Shh смог индуцировать свою нижестоящую цель Patched-1 (Ptch2) (рис. 3G), а также экспрессию Gli1 и α -SMA в клетках NRK-49F (данные не показаны), как сообщалось ранее. ²²

Shh избирательно способствует пролиферации клеток фибробластов in vitro . (A) Типичные микрофотографии показывают фазово-контрастные изображения почечных интерстициальных фибробластов после инкубации с рекомбинантным Shh. NRK-49F инкубировали в течение 3 дней с разными концентрациями Shh, как указано. (B и C) Shh способствует пролиферации фибробластов в зависимости от дозы и времени. Клетки NRK-49F инкубировали с (B) различными концентрациями Shh в течение 3 дней или (C) с фиксированной дозой Shh (100 нг / мл) в течение различных периодов времени, как указано.Подсчитывали и представляли количество клеток (× 1000 на лунку). * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 3). (D) Графическое представление показывает, что Shh способствует пролиферации клеток NRK-49F, оцененной с помощью колориметрического анализа МТТ. * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 3). (E) Типичные микрофотографии показывают, что Shh способствует синтезу ДНК фибробластов, что показано включением BrdU. Клетки NRK-49F инкубировали с 50 и 100 нг / мл Shh в течение 2 дней. Клетки иммуноокрашивали мышиным антителом против BrdU (красный).SYTO-Green (зеленый) использовался для визуализации ядер. Стрелки указывают на BrdU-положительные клетки. (F) Количественное определение процента BrdU-положительных клеток после обработки Shh. * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 3). (G) Ptch2 экспрессируется в почечных фибробластах и ​​индуцируется Shh. Клетки NRK-49 F обрабатывали различными концентрациями Shh в течение 24 часов или 50 нг / мл Shh в течение различных периодов времени, как указано. (H – J) Shh не способствует пролиферации клеток проксимальных канальцев почек.Клетки HKC-8 инкубировали с (H) 100 нг / мл Shh в течение различных периодов времени или (I и J) с разными концентрациями Shh в течение 3 дней. Клеточную пролиферацию оценивали с помощью (H и I) подсчета количества клеток или (J) колориметрического анализа МТТ. (K) Вестерн-блоттинг показывает, что Shh способствует экспрессии множества генов, связанных с пролиферацией, в фибробластах. Клетки NRK-49F инкубировали с Shh (50 нг / мл) в течение различных периодов времени, как указано. Лизаты клеток подвергали Вестерн-блоттингу на c-myc, c-fos, PCNA и актин.

Мы также исследовали, влияет ли Shh на пролиферацию эпителиальных клеток почечных канальцев, в которых Shh активируется (рис. 1 и 2). С этой целью клетки проксимальных канальцев человека (HKC-8) и клетки внутреннего мозгового собирательного протока мыши (mIMCD-3) инкубировали с различными дозами Shh в течение различной продолжительности. Как показано на фиг. 3, H – J, Shh не оказывала влияния на пролиферацию клеток HKC-8. Точно так же Shh также не способствует пролиферации клеток mIMCD-3 (дополнительный рисунок 2). Фактически, он проявлял небольшое, но значительное ингибирование клеток mIMCD-3, как оценивалось с помощью анализа МТТ (дополнительная фигура 2C).Следовательно, ясно, что происходящий из канальцев Shh избирательно нацелен на интерстициальные фибробласты, но не на эпителиальные клетки канальцев, и способствует пролиферации фибробластов в качестве мощного митогена.

Shh активирует гены, связанные с пролиферацией в фибробластах

Чтобы очертить механизм, лежащий в основе Shh-опосредованной пролиферации фибробластов, мы затем исследовали экспрессию многочисленных генов, связанных с пролиферацией, в клетках NRK-49F. Как показано на фиг. 3K, как c-Myc, так и ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) быстро индуцировались Shh в клетках NRK-49F уже при 0.Через 5 часов после обработки. Хотя индукция c-Myc была временной, повышающая регуляция PCNA поддерживалась на протяжении всех экспериментов. Экспрессия c-fos, основного компонента факторов транскрипции AP-1, также индуцировалась Shh в зависимости от времени (рис. 3K). Эти результаты предполагают, что Shh может быстро активировать несколько генов, связанных с пролиферацией, в интерстициальных фибробластах почек, что приводит к усилению пролиферации клеток.

Сверхэкспрессия Shh

Учитывая способность Shh способствовать пролиферации фибробластов in vitro , мы стремились изучить, влияет ли избыточная экспрессия экзогенного Shh in vivo на пролиферацию фибробластов и прогрессирование почек фиброз после ОПП.С этой целью мы использовали мышиную модель IRI, в которой в тканях почек развиваются фиброзные поражения в поздние сроки после ишемической AKI. ^9,26 Как показано на рисунке 4A, вектор экспрессии Shh (pFlag-Shh) или пустой контрольный вектор (pcDNA3) вводили через 3 дня после IRI с помощью метода переноса генов на основе гидродинамики, подхода, который приводит к значительной экспрессии в почках. трансгена. ^30,31 Анализы ОТ-ПЦР показали, что мРНК для Shh и его нижележащего гена-мишени Gli1 индуцировалась через 7 дней после однократной инъекции Shh-экспрессирующей плазмиды (через 10 дней после IRI) (фиг. 4B).Также индуцировался белок Shh, о чем свидетельствовал вестерн-блот-анализ лизатов цельной почки с использованием антител против Shh или против Flag (Фиг.4, C и D). Иммуногистохимическое окрашивание показало, что белок Shh преимущественно индуцировался в эпителии почечных канальцев после инъекции плазмиды (рис. 4E). Точно так же почечная экспрессия эндогенного белка Gli1 также индуцировалась после сверхэкспрессии экзогенного Shh (рис. 4F). Следовательно, доставка генов на основе гидродинамики приводит к сверхэкспрессии Shh в эпителии почечных канальцев in vivo после IRI.

Shh экспрессируется в эпителии почечных канальцев in vivo после гидродинамического переноса гена. (A) Экспериментальный дизайн. Красные стрелки указывают момент почечного IRI. Белые и красные стрелки указывают моменты времени, когда вводили pcDNA3 или pFlag-Shh соответственно. (B) ОТ-ПЦР показывает экспрессию мРНК Shh и Gli1 в почках через 7 дней после инъекции одной плазмиды. (C и D) Вестерн-блоттинг экспрессии почечного белка Shh через 7 дней после инъекции плазмиды.Лизаты почек подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против Shh, Flag или α -тубулина. Представлены репрезентативные (C) Вестерн-блоттинг и (D) количественные данные. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3. Цифры (1–4) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (E) Типичные микрофотографии показывают экспрессию и локализацию почечного белка Shh через 7 дней после инъекции плазмиды. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Масштабная линейка, 50 мкм м. (F) Репрезентативные вестерн-блоты показывают экспрессию почечного белка Gli1 через 7 дней после инъекции плазмиды.

Мы обнаружили, что избыточная экспрессия Shh in vivo способствует пролиферации интерстициальных клеток почек и ускоряет прогрессирование почечного фиброза. Как показано на фиг. 5, A и B, экзогенный Shh стимулировал исключительно пролиферацию клеток в интерстициальном компартменте почек, но не в сегментах канальцев, что было проиллюстрировано иммуногистохимическим окрашиванием Ki67-положительных клеток. Это увеличение пролиферации интерстициальных клеток почек тесно коррелировало с повышенной экспрессией мРНК генов интерстициального матрикса, таких как коллагены типов I и III (рис. 5, C и D).Соответственно, уровни почечного белка рецептора тромбоцитарного фактора роста β (PDGFR- β ), десмина и α -SMA, характерных маркеров активных миофибробластов, ^1,3 также были заметно индуцированы (рис. 5E). Между тем, сверхэкспрессия Shh ускоряет накопление и отложение основных белков интерстициального матрикса, таких как фибронектин, в поврежденных почках (рис. 5E), что было показано вестерн-блоттингом лизатов цельной почки. Соответственно, окрашивание трихромом по Массону (MTS) показало, что экзогенный Shh in vivo усугубляет фиброзные поражения почек после IRI (рис. 5, H и I).

Сверхэкспрессия экзогенного Shh in vivo способствует пролиферации интерстициальных клеток и ускоряет прогрессирование почечного фиброза после AKI. (A) Типичные микрофотографии показывают иммуногистохимическое окрашивание на Ki67 через 7 дней после инъекции плазмиды. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Желтые стрелки указывают на Ki67-положительные клетки. Масштабная линейка, 50 мкм м. (B) Количественное определение Ki67-положительных клеток в почечных канальцах и интерстициальных компартментах.* P <0,05 по сравнению с pcDNA3. HPF, поле большой мощности. (C и D) анализы qRT-PCR показывают, что сверхэкспрессия Shh in vivo способствовала экспрессии в почках (C) коллагена I и (D) коллагена III после IRI. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3 ( n = 4–6). (E) Вестерн-блоттинг экспрессии в почках различных генов, связанных с фиброзом. Лизаты почек подвергали иммуноблоттингу со специфическими антителами против PCNA, PDGFR- β , десмина, фибронектина, α -SMA и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).Цифры (1–4) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (F и G) Графическое представление уровней почечного белка различных генов, связанных с фиброзом. Данные представлены в виде кратной индукции по сравнению с контролями pcDNA3. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3; ** P <0,01 по сравнению с pcDNA3. (H) Типичные микрофотографии показывают отложение коллагена в почках через 7 дней после инъекции плазмиды. Парафиновые срезы подвергали МТС. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Стрелки указывают на область депонирования коллагена с синим окрашиванием.Масштабная линейка 150 мкм м. (I) Графическое представление показывает фиброзные поражения почек через 7 дней после инъекции плазмиды после количественного определения. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3.

Блокада передачи сигналов Shh снижает фиброз почек

Далее мы исследовали, может ли блокада передачи сигналов Shh подавлять пролиферацию фибробластов и уменьшать фиброз почек. С этой целью мы оценили терапевтическую эффективность циклопамина (CPN), низкомолекулярного ингибитора Smoothened (Smo), ^22,32 при установленном повреждении почек, вызванном IRI.Как показано на фиг. 6A, CPN вводили путем ежедневных внутрибрюшинных инъекций, начиная с 3 дней после IRI, момента времени, когда функция почек начинает восстанавливаться после AKI. ³³ Как показано на Фигуре 6B, почечная экспрессия мРНК Gli1, прямой нижестоящей мишени и репортерного гена передачи сигналов hedgehog, была существенно подавлена ​​через 7 дней после введения CPN (10 дней после IRI) in vivo . Точно так же экспрессия почечного белка Gli1 также снижалась после обработки CPN (фиг. 6C).Эти данные указывают на то, что CPN эффективен в блокировании передачи сигнала Shh in vivo . Однако не наблюдалось значительных изменений в экспрессии мРНК Gli2 и Gli3 в почках (дополнительный рисунок 3).

Блокада передачи сигналов Shh снижает фиброз почек после IRI. (A) Экспериментальный дизайн. Зеленые стрелки указывают на инъекцию CPN, тогда как белые стрелки указывают на инъекцию носителя. (B) анализы qRT-PCR показывают, что CPN ингибирует экспрессию мРНК Gli1 в почках. * P <0.05 по сравнению с фиктивным контролем; ^† P <0,05 по сравнению с автомобилями ( n = 3). (C) Репрезентативные вестерн-блоты показывают экспрессию почечного белка Gli1 в различных группах, как указано. Лизаты почек иммуноблотировали с антителами против Gli1 и актина. Veh, автомобиль. (D) Репрезентативные микрофотографии показывают, что CPN улучшает фиброзные поражения почек после IRI. Срезы почек подвергали МТС. Области, выделенные рамкой, увеличены и представлены на нижних панелях. Стрелками обозначены фиброзные участки с синим окрашиванием.Масштабная линейка, 50 мкм м. (E) Количественное определение фиброзных поражений почек в разных группах. Фиброзные поражения почек (определяемые как процент MTS-положительной фиброзной области) количественно оценивали с помощью компьютерного морфометрического анализа. ^† P <0,05 по сравнению с автомобилями. (F – I) анализы qRT-PCR показывают, что CPN ингибирует почечную экспрессию (F) коллагена I, (G) коллагена III, (H) фибронектина и (I) α -SMA после IRI. * P <0,05 по сравнению с фиктивными контролями; ^† P <0.05 по сравнению с транспортными средствами ( n = 3–5).

Мы дополнительно оценили тяжесть почечного фиброза на этой модели после инъекций CPN. Как представлено на фиг. 6, D и E, MTS выявила меньшее количество фиброзных повреждений и снижение отложения коллагена в почках, получавших CPN, по сравнению с контрольными носителями. Соответственно, почечная экспрессия основных генов интерстициального матрикса, таких как коллагены I и III типов и фибронектин, заметно снижалась после введения CPN (рис. 6, F – H). Экспрессия α -SMA, маркера-сигнатуры активных миофибробластов, также ингибировалась обработкой CPN (фиг. 6I).Эти данные показывают, что блокирование передачи сигналов Shh способно улучшить повреждение почек и предотвратить прогрессирование почечного фиброза после IRI.

Блокада передачи сигналов Shh избирательно ингибирует пролиферацию почечных фибробластов

Чтобы изучить механизм, лежащий в основе положительного эффекта CPN, мы исследовали его роль в модулировании пролиферации и увеличения почечных фибробластов in vivo . Как показано на фиг. 7, A и B, экспрессия белка PCNA значительно ингибировалась CPN в фиброзных почках через 10 дней после IRI по сравнению с контрольными носителями.Чтобы определить источники пролиферирующих клеток почек, мы провели двойное иммуноокрашивание на Ki67 (рис. 7C, красный) и ламинин (рис. 7C, зеленый), главный компонент базальной мембраны канальцев. Как показано на Фигуре 7C стрелками, большинство Ki67-положительных клеток было локализовано в интерстициальном компартменте, что указывает на преимущественное увеличение популяции интерстициальных клеток в этот момент времени (10 дней) после IRI. Интересно, что CPN избирательно ингибировал пролиферацию интерстициальных клеток (фигура 7D), но не влиял на пролиферацию канальцевых клеток (фигура 7E).

Блокада передачи сигналов Shh избирательно подавляет пролиферацию интерстициальных фибробластов почек. (A и B) Вестерн-блоттинг показывает, что CPN ингибирует экспрессию PCNA в почках через 10 дней после IRI. Представлены репрезентативные (A) Вестерн-блоттинг и (B) количественные данные. * P <0,05 по сравнению с транспортным средством. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (C) Типичные микрофотографии показывают, что CPN ингибирует пролиферацию интерстициальных клеток почек после IRI. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на Ki67 (красный) и ламинин (зеленый) показывает, что Ki67-положительные клетки преимущественно локализовались в интерстициальном компартменте.Области, выделенные рамкой, увеличены и представлены на правых панелях. Стрелки указывают на Ki67-положительные клетки в интерстиции, тогда как стрелки обозначают тубулярные клетки с Ki67-положительным окрашиванием. Масштабная линейка, 50 мкм м. (D и E) CPN избирательно ингибирует пролиферацию интерстициальных, но не канальцевых клеток in vivo после IRI. Приведены количественные данные о Ki67-положительных клетках в интерстициальном (D) и канальцевом (E) компартментах. * P <0,05 по сравнению с транспортным средством. (F и G) Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание показывает определение Ki67 (красный) и различных клеточных маркеров (зеленый) в почках через 10 дней после IRI.Используемые маркеры, специфичные для определенного типа клеток, включают CD31 (эндотелиальные клетки), CD45 (лейкоциты) и α -SMA (миофибробласты). Количественные данные о стоимости для Ki67 и различных маркеров, специфичных для типов клеток, представлены в G. DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол. (H – J) Вестерн-блоттинг почечного PDGFR- β , десмина, фибронектина. и экспрессия α -SMA через 10 дней после IRI. Представлены репрезентативные (H) Вестерн-блоттинг и (I и J) количественные данные. * P <0.05 по сравнению с автомобилем. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. Fn, фибронектин. (K) Типичные микрофотографии иммуногистохимического окрашивания показывают, что CPN ингибирует экспрессию PDGFR- β в почках и экспрессию десмина после IRI. Стрелки указывают положительные клетки. Масштабная линейка, 50 мкм м. HPF, поле большой мощности.

Для дальнейшего выяснения идентичности этих пролиферирующих интерстициальных клеток мы выполнили дополнительное определение стоимости для Ki67 (рис. 7F, красный) и различных маркеров, специфичных для типа клеток (рис. 7F, зеленый).Как показано на Фигуре 7F, не было определения стоимости Ki67 и CD31, специфического маркера эндотелиальных клеток. Точно так же наблюдалась небольшая стоимость Ki67 и CD45, общего лейкоцитарного маркера. Однако Ki67 в значительной степени был локализован с α -SMA, маркером миофибробластов (фигура 7F, стрелки). Количественное определение показало, что более 80% Ki67-положительных клеток были α -SMA-положительными миофибробластами в пораженных почках после IRI (рис. 7G), что свидетельствует о преимущественной пролиферации фибробластов через 10 дней после IRI.Следовательно, CPN в значительной степени нацелился на фибробласты и избирательно предотвращал их пролиферацию и рост.

В соответствии со сниженной пролиферацией фибробластов обработка CPN также ингибировала экспрессию PDGFR- β и десмина, двух сигнатурных белков, которые определяют активацию фибробластов. Как проиллюстрировано анализами вестерн-блоттинга, почечный PDGFR- β и десмин были значительно снижены после инъекции CPN по сравнению с контрольными носителями (фиг. 7, H и I). Иммуногистохимическое окрашивание также выявило заметное подавление экспрессии PDGFR- β и десмина с помощью CPN (фиг. 7K).Соответственно, CPN также значительно ингибировал почечную экспрессию α -SMA и белков фибронектина (фиг. 7, H и J). Эти результаты показывают, что блокада передачи сигналов Shh с помощью CPN снижает фиброз почек за счет избирательного ингибирования пролиферации и активации фибробластов в пораженных почках.

Обсуждение

Пролиферация и активация интерстициальных фибробластов являются основными и частыми патологическими признаками ХЗП, которые в конечном итоге приводят к увеличению популяции продуцирующих матрикс клеток в пораженных почках.Однако идентичность и источники внеклеточных сигналов, контролирующих пролиферацию фибробластов, остались плохо изученными. Результаты, представленные в этом исследовании, показывают, что происходящий из канальцев Shh является новым, индуцибельным и мощным митогеном, который специфически способствует пролиферации фибробластов в соседнем интерстиции. Этот вывод подтверждается несколькими линиями in vitro и in vivo доказательства. Наши данные иллюстрируют решающую роль Shh в регуляции разрастания фибробластов и фиброза почек после повреждения почек, прежде всего через посредничество EMC.

Shh является прототипом трех лигандов в сигнальной системе hedgehog. Это секретируемый белок, модифицированный холестерином и пальмитоилом, и он функционирует как классический морфоген, вещество, регулирующее формирование тканевого паттерна во время развития млекопитающих. ^34,35 Shh проявляет свое действие посредством связывания с рецептором плазматической мембраны Ptch2, что ведет к интернализации и деградации Ptch2, приводя к дерепрессии семимембранного G-белка-связанного с рецептором подобного рецептору. ^17,36 В нормальных почках взрослого человека ген Shh находится в относительно спокойном состоянии, и его экспрессия практически не обнаруживается у мышей, крыс и людей (Рисунки 1 и 2).Однако экспрессия Shh явно индуцируется преимущественно в эпителии почечных канальцев после повреждения почек. Следует отметить, что, хотя мы ранее показали индукцию Shh в UUO мыши, ²² , другой отчет указывает, что она не изменилась в той же модели. ²³ Точная причина такого несоответствия остается неизвестной, но это может быть связано с конкретной используемой методологией. Fabian et al. ²³ оценивали экспрессию Shh только с помощью ОТ-ПЦР, подхода, который подвержен вариациям специфичности праймеров и условий эксперимента.Напротив, наши результаты по индукции Shh после UUO были показаны с помощью комбинации RT-PCR, вестерн-блоттинга и иммуногистохимического окрашивания. ²² Используя три дополнительных модели почечного фиброзного заболевания, мы теперь подтвердили, что Shh индуцируется в пораженных почках после IRI, ADR и удаления почечных опухолей (Рисунок 1). Кроме того, Shh также индуцируется в биоптатах почек человека от пациентов с различными заболеваниями почек с различной этиологией (рис. 2), что свидетельствует о клинической значимости индукции Shh для возникновения и прогрессирования заболеваний почек человека.Взятые вместе, наши данные показывают, что экспрессия Shh индуцируется во всех четырех моделях животных (UUO, IRI, ADR-нефропатия и остаточная почка после нефрэктомии 5/6), протестированных и с ХЗП человека, что указывает на то, что индукция Shh является универсальным и частым явлением в патогенез широкого спектра ХБП.

Хотя Shh преимущественно индуцируется в эпителии почечных канальцев пораженных почек, он избирательно нацеливается и специфически способствует пролиферации интерстициальных фибробластов (Рисунки 1 и 3). Это открытие согласуется с более ранними сообщениями об использовании Gli1 ^LacZ мышей, у которых почечный Gli1 избирательно индуцируется в активных фибробластах в интерстициальном компартменте после UUO. ^22,23 В этом исследовании мы повторно рассмотрели этот вопрос с использованием мышей Gli-CreER ^T2 и показали, что Cre, управляемый Gli1, специфически экспрессируется в виментин-позитивных фибробластах, но не в CD45-позитивных лейкоцитах и ​​CD31-позитивных эндотелиальных клетках. клетки (рисунок 1) после IRI. Таким образом, используя две модели (UUO и IRI) и разных репортерных мышей (Gli1 ^LacZ и Gli-CreER ^T2 ), мы четко установили, что Shh, происходящий из канальцев, избирательно нацеливается на интерстициальные фибробласты, что приводит к их пролиферации и активации. ²² Способность Shh стимулировать пролиферацию фибробластов весьма впечатляюща, о чем судили по подсчету клеток, анализу МТТ и оценке включения BrdU (рис. 3), предполагая, что Shh, полученный из канальцев, может быть долгожданным мощным митогеном, который контролирует разрастание и разрастание фибробластов в прилегающем интерстиции. Хотя это не было проверено, существует вероятность того, что Shh также может влиять на выживаемость фибробластов. Идентификация Shh как фактора роста фибробластов также согласуется с появляющимися доказательствами того, что повреждение канальцев является ранним и основным событием в почечном фиброгенезе. ^9,10 Таким образом, наши исследования установили, что Shh, растворимый фактор, происходящий из поврежденных канальцев, играет решающую роль в определении размера популяции фибробластов в пораженных почках, прежде всего, опосредуя EMC.

Процесс перехода фибробластов в миофибробласты во время почечного фиброза проявляется усилением пролиферации клеток, de novo экспрессией α -SMA, усилением продукции интерстициального матрикса и потерей способности продуцировать эритропоэтин. ^1,4,37 Похоже, что Shh является полным фиброгенным митогеном, который не только способствует пролиферации фибробластов, но также индуцирует их миофибробластический переход, поскольку Shh способен индуцировать α -SMA, коллаген I, фибронектин и экспрессию десмина в культивированные фибробласты, как сообщалось ранее. ²² Эти комбинированные эффекты Shh на пролиферацию фибробластов и фенотипический переход могут привести к резкому увеличению популяции продуцирующих матрикс клеток в пораженных почках.Однако, происходит ли Shh-индуцированная пролиферация фибробластов и их миофибробластическая активация параллельно или последовательно, еще предстоит определить. Более того, также неясно, опосредуются ли пролиферация фибробластов и фенотипический переход, контролируемые Shh, общими или отдельными внутриклеточными сигнальными путями.

Наиболее интересным открытием этого исследования является подтверждение решающей роли Shh в обеспечении пролиферации фибробластов и фиброза почек in vivo .Используя подход, основанный на усилении или потере функции, мы показываем, что Shh способствует фиброзу почек во время перехода от ОПН к ХБП после травмы, и эта проблема все чаще признается в клинических исследованиях. ^38–40 В соответствии с данными in vitro , сверхэкспрессия Shh с помощью подхода доставки генов, основанного на гидродинамике, приводит к значительной экспрессии функционального Shh, что было показано с помощью индукции мРНК и белка Gli1 в почках (рис. 4), и заметно ускоряет прогрессирование фиброзных поражений почек (рис. 5).Мы решили манипулировать экспрессией Shh через 3 дня после IRI, потому что к этому моменту острая фаза повреждения и восстановления почек в этой модели почти завершена, о чем судят по уровню креатинина в сыворотке. ^9,33 Соответственно, ингибирование передачи сигналов Shh ингибитором Smo CPN также избирательно блокирует пролиферацию интерстициальных фибробластов и уменьшает фиброз почек (Фигуры 6 и 7). Эти результаты однозначно показывают фундаментальную роль передачи сигналов Shh в контроле пролиферации фибробластов и почечного фиброза in vivo и предполагают, что блокада передачи сигналов Shh с помощью низкомолекулярного ингибитора может быть правдоподобной стратегией терапевтического вмешательства при ХБП.

Таким образом, используя несколько моделей на животных и биопсии почек человека, мы показали, что индукция Shh по канальцам является частым патологическим признаком при большом разнообразии ХБП. Эти исследования также идентифицируют Shh как новый, специфический и мощный митоген, который избирательно способствует пролиферации фибробластов in vitro и in vivo . Следовательно, Shh может быть долгожданным фибробласт-специфическим фактором роста из канальцев в поврежденных почках. Наши результаты также подтверждают принцип, согласно которому блокада передачи сигналов Shh может быть новой стратегией терапевтического лечения почечного фиброза при ХБП.

Краткие методы

Модели на животных

Самцов мышей BALB / c массой около 20-25 г были получены от Harlan Sprague – Dawley. Почечный IRI был выполнен на мышах BALB / c с использованием установленного протокола, как описано в другом месте. ⁴¹ Вкратце, двусторонние почечные ножки зажимали в течение 35 минут с помощью зажимов для микроаневризмы. Во время ишемического периода температура тела поддерживалась между 35 ° C и 37,5 ° C с помощью системы нагрева с регулируемой температурой. Через 3 дня после IRI мышей подвергали либо однократной внутривенной инъекции плазмиды экспрессии Shh (фиг. 4A), либо ежедневным внутрибрюшинным инъекциям CPN (Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури) в дозе 5 мг / кг массы тела в течение 7 дней (Фигура 6А), как сообщалось ранее. ^22,31 Мышей умерщвляли через 10 дней после IRI, и ткани почек собирали для различных анализов. Для модели нефропатии ADR самцам мышей BALB / c вводили ADR (гидрохлорид доксорубицина; Sigma-Aldrich) путем однократной внутривенной инъекции в дозе 10 мг / кг массы тела, как сообщалось ранее. ²⁴ Мышей умерщвляли через 5 недель после инъекции ADR. Кроме того, модель остаточной почки была создана у самцов крыс Sprague-Dawley путем нефрэктомии 5/6, как описано в другом месте. ²⁵ Почки собирали через 12 недель и подвергали различным анализам.

В отдельных экспериментах трансгенные мыши Gli1-CreER ^T2 , у которых рекомбиназа Cre находится под контролем эндогенных элементов промотора / энхансера Gli1, были получены из лаборатории Джексона (запас № 007913). ⁴² Мышам внутрибрюшинно вводили тамоксифен (T5648; Sigma-Aldrich) в дозе 25 мг / кг веса тела в течение 5 дней, а затем подвергали IRI, как описано выше. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных в Университете Питтсбурга.

Конструирование вектора экспрессии Shh и

Плазмидный вектор, содержащий кДНК Shh человека, был получен от Addgene (pBS-hShh, # 13996). Вставку кДНК Shh высвобождали и субклонировали в вектор экспрессии млекопитающих p3xFlag (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния), используя рутинную методику молекулярного клонирования. Пустой вектор экспрессии pcDNA3 был приобретен у Invitrogen. Плазмидную ДНК вводили мышам с помощью метода переноса генов, основанного на гидродинамике, путем быстрой инъекции большого объема раствора ДНК через хвостовую вену, как описано в другом месте. ³⁰ Вкратце, 20 мкл г плазмидной ДНК разводили в 1,8 мл физиологического раствора и вводили через хвостовую вену в кровоток мыши в течение 5-10 секунд. Мышам контрольной группы аналогичным образом инъецировали 20 мкг г пустого вектора pcDNA3. Плазмиды вводили через 3 дня после IRI, мышей умерщвляли через 10 дней (фиг. 4A) и собирали образцы ткани почек.

Образцы биопсии почек человека

Образцы почек человека были получены из диагностических биопсий почек, выполненных в больнице Наньфанг Южного медицинского университета.Неопухолевую ткань почек пациентов с почечно-клеточным раком, перенесших нефрэктомию, использовали в качестве нормального контроля. Залитые в парафин биопсийные срезы почек человека (2,5- мкм толщиной мкм) получали с использованием стандартной процедуры. Все исследования с участием срезов почек человека были одобрены институциональным наблюдательным советом Питтсбургского университета и институциональным этическим комитетом Южного медицинского университета.

Клеточная культура

Клетки NRK-49F и mIMCD-3 были получены из Американской коллекции типовых культур.HKC-8 был предоставлен Л. Ракузеном (Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд). Клетки поддерживали, как описано ранее. ²² Клетки NRK-49F, HKC-8 и mIMCD-3, лишенные сыворотки, обрабатывали рекомбинантным человеческим белком Shh (StemRD Inc., Burlingame, CA) в различных концентрациях в течение различных периодов времени, как указано. Затем клетки собирали и подвергали различным анализам.

Анализ пролиферации клеток

Пролиферацию клеток оценивали двумя подходами: подсчетом клеток и анализом МТТ.Количество клеток подсчитывали с помощью гемацитометра. Клеточную пролиферацию также определяли количественно с помощью МТТ-анализа. Вкратце, клетки NRK-49F, HKC-8 и mIMCD-3 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2 × 10 ³ / лунку. После прикрепления клеток культуры заменяли бессывороточной средой и инкубировали в течение 24 часов с последующей обработкой Shh или без Shh в различных концентрациях в течение различных периодов времени, как указано. МТТ (5 мг / мл) добавляли к среде в количестве 10 мкл мкл / лунку с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 4 часов.После удаления среды клетки лизировали 100 мкл мкл диметилсульфоксида. Поглощение каждой лунки измеряли считывателем микропланшетов при длине волны 490 нм.

Анализ включения BrdU

Влияние Shh на синтез ДНК фибробластов оценивали по включению BrdU. Вкратце, клетки высевали на 24-луночные планшеты и обрабатывали различными концентрациями Shh в течение 48 часов, а затем им пульсировали BrdU (10 мкМ М) в течение 24 часов. Клетки фиксировали ледяным 70% этанолом в течение 20 минут, и ДНК денатурировали путем инкубации с 2.5 н. HCl в течение 20 минут с последующей нейтрализацией 0,1 М борной кислотой. Активность эндогенной пероксидазы гасили инкубацией клетки с 3% H ₂ O ₂ в PBS в течение 20 минут, а неспецифическое связывание блокировали путем инкубации клеток с 10% ослиной сывороткой в ​​течение 10 минут при комнатной температуре, как описано ранее. ⁷ Инкорпорированный BrdU детектировали с помощью мышиного моноклонального антитела против BrdU (B2531; Sigma-Aldrich) с последующей инкубацией с конъюгированным с цианином Cy3, аффинно очищенным вторичным антителом (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA).Окрашенные клетки помещали в среду для закрепления противоэпидемических элементов Vectashield, используя SYTO-Green для визуализации ядер. Окрашенные образцы просматривали под эпифлуоресцентным микроскопом Eclipse E600, оборудованным цифровой камерой (Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк).

qRT-PCR в реальном времени

Полную РНК экстрагировали с использованием системы выделения РНК TRIzol (Invitrogen). Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора для системы обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя (Promega, Madison, WI).qRT-PCR выполняли в системе определения последовательности ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), как описано ранее. ²² Последовательности пар праймеров для различных генов показаны в дополнительной таблице 2. ПЦР проводили в стандартных условиях. Уровни мРНК различных генов рассчитывали после нормализации с помощью β-актина.

Вестерн-блот-анализ

Ткани почек лизировали буфером для анализа радиоиммунопреципитации, содержащим 1% NP-40, 0,01 тергитол-типа.1% SDS, 100 мкл г / мл PMSF, 1% коктейль ингибиторов протеазы и 1% коктейль ингибиторов фосфатазы I и II (Sigma-Aldrich) в PBS на льду. Супернатанты собирали после центрифугирования при 13000 × g при 4 ° C в течение 15 минут. Экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга, как описано ранее. ⁴³ В качестве первичных используемых антител были анти-Shh (sc-9024), анти-PDGFR- β (sc-432), анти-PCNA (sc-56) и анти-c-Myc (sc-40s). от Santa Cruz Biotechnology, анти-Gli1 (AF3455) от R&D Systems, антифибронектин (F3648), анти– α -SMA (A2547), антидесмин (D1033), анти-Flag (F4042) и анти– α -тубулин (T9026) от Sigma-Aldrich, анти-c-fos (PC05) от Calbiochem, анти-актин (MAB1501) от Chemicon и анти-GAPDH (# 2118s) от Cell Signaling Technology.

Гистология и иммуногистохимическое окрашивание

Залитые парафином срезы почек мыши (3- мкм толщиной мкм) получали обычным способом. Срезы окрашивали реагентами MTS по стандартному протоколу. Иммуногистохимическое окрашивание проводили согласно установленному протоколу, как описано ранее. ⁴¹ Антитела против Shh (sc-9024; Santa Cruz Biotechnology), PDGFR- β (sc432; Santa Cruz Biotechnology), десмина (D1033; Sigma-Aldrich) и Ki67 (ab66155; Abcam, Inc.) были использованы.

Коиммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия

Криосрезы почек фиксировали 3,7% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре и погружали в 0,2% Triton X-100 на 10 минут. После блокирования 10% ослиной сывороткой в ​​PBS в течение 1 часа слайды были коиммуноокрашены следующими антителами: анти-Cre (MAB3120; EMD Millipore), анти-Ki67 (ab66155; Abcam, Inc.), анти-ламинин (L8271; Sigma). -Aldrich), анти- α -SMA (A2547; Sigma-Aldrich), анти-CD45 (ab60291; Abcam, Inc.) и анти-CD31 (550274; BD Pharmingen). Для визуализации первичных антител слайды окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с цианином Cy2 или Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Окрашенные слайды просматривали под конфокальным микроскопом Leica TCS-SL, оснащенным цифровой камерой.

Статистический анализ

Все данные были выражены как средние значения ± SEM. Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения SigmaStat (Jandel Scientific Software, Сан-Рафаэль, Калифорния). Сравнения между группами проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Ньюмана-Кеулса. P <0,05 считалось значимым.

Выражение признательности

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения DK064005 и DK0, грантом Национальной программы 973 ​​2012CB517700 и Национальным научным фондом Китая грантами 81130011 и 81370839. RJT был поддержан Национальными институтами здравоохранения и докторской стипендией K06-DK06-DK06-DK06. Переходный грант Американской кардиологической ассоциации 13FTF169.

• Авторские права © 2014 Американского общества нефрологов

Критические роли ARHGAP36 как медиатора передачи сигнала пути Shh в спецификации боковых столбчатых двигателей

[…] Решение этих различных проблем потребует новых экспериментов, которые, вероятно, займут значительно больше времени, чем обычно выделяются два месяца на редактирование рукописей eLife.Поэтому мы с сожалением решили отклонить вашу рукопись.

Одна из основных проблем рецензентов заключалась в том, могла ли делеция Shh в эмбрионах мышей с использованием линии делетеров Olig2-Cre исключить дефекты формирования паттерна или пролиферации из-за элиминации Shh в вентральных предшественниках, а не в постмитотических нейронах. Автор обзора указал, что «поскольку Olig2 изначально экспрессируется в самом вентральном домене спинного мозга, за исключением наиболее медиальных клеток [1], нельзя исключить, что Shh был удален Olig2-Cre из клеток в раннем Olig2. ⁺ предшественник домена, что приводит к наблюдаемому фенотипу.«

Мы понимаем, почему рецензент выразил озабоченность тем, что Shh, секретируемый из пластинки пола, имеет решающее значение для формирования паттерна вентральной нервной трубки, влияя, таким образом, на последующую дифференцировку мотонейронов. Однако данные моей лаборатории и других групп показывают, что экспрессия Shh в пластине пола не нарушена в нашей модели мыши Shh-cKO; Olig2-Cre, исключая возможность того, что наблюдаемый фенотип вызван делецией Shh в полу. тарелка.

Во-первых, важно отметить, что Shh специфически экспрессируется в пластинке дна, но не в нейронах, на ранней стадии развития спинного мозга, когда вентральные предшественники подвергаются Shh-зависимому формированию паттерна.Наши данные гибридизации in situ (рис. 1A, B) согласуются с предыдущими отчетами. Кроме того, подтверждая характерный для донной пластинки паттерн экспрессии Shh, активность Shh-Cre также обнаруживается исключительно в донной пластине [2] (см. Рисунок 1N ‘, N «из Varadarajan et al., 2017 Neuron [3]).

Во-вторых, Olig2-Cre не активен в плите пола. Например, Varadarajan et al. 2017 Neuron [3] изобразил активные клетки Olig2-Cre и их потомство путем скрещивания делетера Olig2-Cre с репортерными мышами Rosa26-gfp, и данные показывают, что GFP не экспрессируется в пластине дна (см. Рисунок 2FF у Varadarajan et al., 2017 Нейрон [3]). Мы также скрестили Olig2-Cre с репортерным аллелем, определяющим Cre-опосредованную рекомбинацию, и обнаружили, что Olig2-Cre не активен в дне планшета.

Как описано рецензентом, Рис. 1H Dessaud et al., 2007 [1] ясно показывает, что Olig2 , а не , экспрессируется в MOST медиальных клетках, которые представляют собой пластинку дна. Самый вентральный домен спинного мозга, в котором Olig2 первоначально экспрессируется в этой статье [1], является доменом p3, который дает начало интернейронам V3.Важно отметить, что интернейроны V3 не экспрессируют Shh.

Взятые вместе, когда происходит формирование паттерна вентральных нейральных предшественников, Olig2-Cre является , а не активным в клетках пластинки дна, которые являются единственными типами клеток, которые экспрессируют Shh на этой стадии. Т.о., делеция гена Shh с помощью Olig2-Cre не должна влиять ни на экспрессию Shh в нервной трубке, ни на Shh-зависимое формирование паттерна вентральных доменов-предшественников, включая домен pMN.

Наконец, фенотип мышей Shh-cKO; Olig2-Cre дополнительно подтверждает мнение о том, что наблюдаемый фенотип , а не , вызван делецией Shh в пластине пола.Shh в пластине пола необходим для формирования паттерна вентрального спинного мозга, продукции pMN клеток и генерации мотонейронов и вентральных интернейронов [4]. Таким образом, если Shh в пластине пола отсутствует или снижен у Shh-cKO; Olig2-Cre эмбрионов, это приведет к полной потере или резкому сокращению предшественников Olig2 ⁺ pMN, всех типов двигательных нейронов и интернейронов V2. . Однако мы не обнаружили существенной разницы в количестве предшественников Olig2 ⁺ pMN в проанализированных Shh-cKO; Olig2-Cre и контрольных эмбрионах (рис. 3B, C), что указывает на то, что уровень Shh, секретируемый из дна, был достаточен для управления. формирование и изготовление pMN.В исправленную рукопись мы включили данные количественной оценки количества клеток Olig2 ⁺ в Shh-cKO; Olig2-Cre и контрольных эмбрионах (рис. 3B, C). Мы также обнаружили, что только двигательные нейроны FoxP1 ⁺ LMC, но ни Lhx3 ⁺ Hb9 ⁺ MMC, Isl1 ⁺ Hb9 ⁺ двигательные нейроны HMC, ни Lhx3 ⁺ Hb9 ^— V2 были уменьшены между нейронами. у мышей Shh-cKO; Olig2-Cre (рис. 3A, C). Эти данные дополнительно подтверждают мнение о том, что Shh секретируется из пластинки дна у Shh-cKO; мышей Olig2-Cre было достаточно, чтобы управлять формированием паттерна вентрального спинного мозга и продуцированием клеток pMN, и что уменьшенный мотонейрон LMC не является вторичным результат дефектов в нейральных предшественниках.

Мы надеемся, что они решают озабоченность автора обзора тем, что наблюдаемый фенотип может быть вызван делецией Shh в предшественниках Olig2 ⁺ .

Затем рецензент №2 подчеркнул необходимость использования специфичного для мотонейрона драйвера, такого как линия Hb9-Cre. Мы уже приобрели Hb9-Cre для этой цели, но Hb9-Cre оказался проблематичным для наших экспериментов, потому что Hb9 экспрессируется (следовательно, Hb9-Cre активен) в хорде, которая секретирует Shh, необходимый для развития нервной трубки [ 5].Поскольку Hb9-Cre удаляет Shh в хорде и устраняет Shh, необходимый для формирования паттерна вентральной нервной трубки, Hb9-Cre не может быть использован для нашего эксперимента. Чтобы обойти эту проблему, мы также использовали Isl1-Cre, экспрессия Cre которого происходит, когда моторные нейроны выходят из предков. Мы генерировали Shh-cKO с Isl1-Cre и обнаружили, что Shh-cKO; Isl1-Cre мыши имеют серьезные дефициты в развитии конечностей, поскольку Isl1-Cre инактивирует Shh в развивающейся конечности [2, 6, 7]. Дефицит развития конечностей у Shh-cKO; Isl1-Cre составил наш анализ развития LMC, учитывая, что наблюдаемые дефекты мотонейронов LMC могут быть вторично вызваны тяжелыми дефектами развития конечностей.Таким образом, Hb9-Cre неадекватен для удаления Shh только в двигательных нейронах, а Olig2-Cre был лучшей линией, которую мы могли бы использовать для неактивного Shh в двигательных нейронах. Наконец, наши данные показывают, что наблюдаемые фенотипы у мышей Shh-cKO; Olig2-Cre вызваны инактивацией Shh в мотонейронах, а не удалением Shh в пластине пола, чего не происходит у Shh-cKO; Olig2-Cre мышей, как описано выше.

Другие проблемы включают отсутствие достаточного анализа, чтобы исключить дефекты формирования паттерна, пролиферации или выживания в подвергнутых манипуляции эмбрионах кур и мышей (рецензент 1 балл 1; рецензент 2 балла 5 и 6), а также недостаточную количественную оценку данных (рецензент 1 балл 2 ; рецензент 2 балла 4, 8, 14, 17, 19, 22-25).Мы рассмотрели эти проблемы, как описано ниже. В частности, что касается проблемы электропорации цыплят с использованием нокдаун-конструкции Shh, эффективность электропорации клеток дна пластины обычно очень низкая. В нашей схеме электропорации все электропорированные клетки помечены GFP. Чтобы лучше учесть опасения рецензента, мы проанализировали куриные эмбрионы, которые не экспрессируют GFP на дне чашки (следовательно, не инактивируют Shh), что было подтверждено гибридизационным анализом экспрессии Shh in situ.Мы также подтвердили, что формирование паттерна и пролиферация клеток у проанализированных куриных эмбрионов нормальны (рис. 2А, С). Эти строгие анализы исключают возможность того, что любые наблюдаемые фенотипы вызваны эффектом делеции Shh у предков.

После успешного завершения всех запрошенных исправлений мы надеемся, что вы и рецензенты сочтете эту рукопись интересной и убедительной. В частности, мы надеемся подчеркнуть, что эта история представляет по крайней мере два новаторских открытия; новая функция Shh в постмитотических нейронах и его критический нижестоящий эффектор ARHGAP36 в управлении развитием специфических типов MNs (LMC-MNs) в развивающемся спинном мозге.Наши результаты идентифицируют новую регуляторную ось, состоящую из AKT-ARHGAP36-PKA, которая играет решающую роль в передаче сигнала Shh для спецификации LMC.

Рецензент № 1:

Эта статья сообщает о новой роли Shh, продуцируемой постмитотическими мотонейронами, в спецификации латерального моторного столба (LMC) в спинном мозге цыплят и мышей. Авторы показывают, что AKT стабилизирует Rho GAP-белок ARHGAP36 в области LMC, и что ARHGAP36, в свою очередь, ингибирует активность PKA и тем самым усиливает продукцию активирующих форм Gli-белков.

Идентификация роли Shh в спецификации моторных нейронов и выяснение нисходящего пути, включающего новый регулятор и множественные сигнальные молекулы, представляет значительный интерес. Данные подтверждают выводы авторов, и работа отличного качества и хорошо представлена. У меня есть несколько просьб об улучшении данных, анализа и обсуждения, чтобы укрепить выводы документа.

Спасибо за признание того, что наши открытия предоставляют новое понимание роли передачи сигналов Shh в спецификации судьбы двигательных нейронов посредством нового нисходящего пути, включающего несколько сигнальных молекул.Мы также хотели бы поблагодарить рецензента за множество проницательных предложений. Мы рады, что смогли решить все проблемы, поднятые рецензентом №1, как описано ниже по каждому пункту рецензента.

1) Shh действует как митоген во многих системах, но авторы исключают, что это имеет место здесь, маркируя предшественники MN антителами к Olig2 и Sox2 на рисунке 2C. Однако фенотип Shh LOF на рис. 2A влияет только на генерацию небольшого меньшинства MNs, что может быть связано с дефектом пролиферации, затрагивающим только небольшую фракцию предшественников, которые не могут быть обнаружены текущим анализом.Чтобы исключить это, авторы должны исследовать пролиферирующие клетки более непосредственно, например, с помощью короткого импульса EdU. Это должно выявить предполагаемый дефект пролиферации с большей чувствительностью, чем изучение общего количества предшественников.

По предложению рецензента мы выполнили короткий импульс мечения BrdU и окрашивания Ki67. Наш анализ показал, что у мышей Shh-cKO не обнаружено значительных изменений в пролиферации предшественников по данным четырех независимых маркеров, таких как Olig2, Ki67, Sox2 и BrdU (Рисунок 3B, C и Рисунок 3 — приложение к рисунку 1B).

2) Эктопическая экспрессия ARHGAP36 в вентральном спинном мозге на фиг. 5B заметно увеличивает количество FoxP1 + LMC нейронов, в то время как нейроны Lhx3 + Hb9 + MMCm, по-видимому, не затронуты. Однако чтобы сделать вывод о том, что ARHGAP36 индуцирует нейроны LMC, а не превращает MMCm в LMC, требуется количественная оценка данных.

Мы включили количественные данные для нейронов FoxP1 ⁺ LMC и MMC (Lhx3 ⁺ Hb9 ⁺ ) (рисунок 6B).

3) Вывод эксперимента на фиг. 6A о том, что AKT стабилизирует белок ARHGAP36, должен быть усилен путем измерения периода полужизни ARHGAP36 в клетках HEK293T в присутствии и в отсутствие AKT, а также путем демонстрации того, что манипулирование активностью AKT не влияет на транскрипцию ARHGAP36.

Мы включили данные, показывающие, что период полужизни белка ARHGAP36 увеличивался в присутствии AKT при обработке циклогексимидом, который блокирует трансляцию белка (рисунок 7 — рисунок в приложении 1).

Мы также подтвердили, что ингибитор AKT снижает уровень белка ARHGAP36 с помощью вестерн-блоттинга (Рисунок 7B, Рисунок 7 — приложение к рисунку 2C), но не транскрипцию Arhgap36 с помощью RT-PCR (Рисунок 7 — рисунок приложение 2D) в эмбриональных стволовых клетках мыши. (мЭСК).

4) Регуляция экспрессии ARHGAP36 может потребовать дальнейшего обсуждения.На рис. 6 показано, что AKT контролирует стабильность белка ARHGAP36, но менее ясно, как регулируется его транскрипция. Рисунок 2 — рисунок в приложении 1 показывает снижение его экспрессии у мышей Shh cKO. Как Shh регулирует его экспрессию и есть ли другие сигналы? Вдоль той же линии стрелка между Shh и P-AKT на рисунке 7D может потребовать дополнительных пояснений.

На фиг. 7, чтобы проверить влияние активности AKT на регуляцию стабильности белка ARHGAP36, мы эктопически экспрессировали ARHGAP36 вместе с различными формами AKT путем трансфекции клеток HEK293T плазмидами, которые кодируют гены ARHGAP36 и AKT.Поскольку ARHGAP36 не экспрессируется эндогенно в клетках HEK293T, в этих клетках белки ARHGAP36 экспрессируются только из плазмиды, кодирующей ARHGAP36, в которой промотор CMV управляет транскрипцией ARHGAP36. Эти эксперименты показывают, что активный AKT увеличивает уровни белка ARHGAP36, предполагая, что AKT увеличивает белки ARHGAP36, вероятно, за счет стабилизации белка ARHGAP36, а не транскрипционной активации промотора ARHGAP36 в этих экспериментальных условиях.

Чтобы дополнительно проверить, регулируется ли эндогенная транскрипция ARHGAP36 с помощью AKT в дифференцирующихся двигательных нейронах, мы использовали систему mESC, в которой ARHGAP36 индуцируется в условиях дифференцировки двигательных нейронов.В этом состоянии ингибитор AKT не влиял на уровень мРНК ARHGAP36 (см. Ответ выше и рисунок 7 — рисунок в приложении 2D), что позволяет предположить, что AKT не участвует в транскрипционной активации гена ARHGAP36.

Тогда как Shh увеличивает уровни ARHGAP36? Примечательно, что Shh способен индуцировать активацию фосфоинозитид-3-киназы (PI3-киназы) -зависимого фосфорилирования AKT в клеточных линиях (клетки LIGHT и клетки HUBEC) [8, 9]. Мы предположили, что Shh, экспрессируемый в двигательных нейронах, запускает активацию AKT, которая, в свою очередь, стабилизирует уровень белка ARHGAP36 в двигательных нейронах.Наша модель предсказывает, что уровень белка ARHGAP36 будет снижен у мышей Shh -cKO.

Рецензент № 2:

Рукопись Nam and cols, озаглавленная «Критические роли ARHGAP36 как медиатора передачи сигналов для пути Shh в латеральной моторной столбчатой ​​спецификации», предлагает новую роль передачи сигналов Shh в развитии спинного мозга.

Предполагаемая роль активности Shh как сигнала, определяющего выбор конкретных субпопуляций MN, является новой и привлекательной.Он основан на наблюдении экспрессии Shh в постмитотических МН, что не является полностью новым, но не было хорошо охарактеризовано ранее.

Авторы также обнаружили, что член семейства Rho GAP Arhgap36 экспрессируется в постмитотических MNs, и предполагают, что он может действовать как Shh-эффектор при отборе субпопуляций MN. Ранее было показано, что в различных клеточных контекстах Arhgap36 ингибирует активность PKA, следовательно, регулирует передачу сигналов Shh. Однако было бы неплохо полностью определить его актуальность in vivo в контексте отбора конкретных субпопуляций MNs.Таким образом, рукопись содержит некоторые новые и интересные данные, однако в ней отсутствуют окончательные демонстрации некоторых выводов, сделанных авторами.

Следовательно, я считаю, что в нынешнем формате рукопись имеет важные пробелы, которые необходимо заполнить.

Мы ценим признание того, что наши находки обеспечивают новую роль передачи сигналов Shh и его эффектора ARHGAP36 в генерации специфической субпопуляции MNs, и мы хотели бы поблагодарить рецензента за множество отличных предложений.Как описано ниже, теперь мы предоставили все количественные, контрольные и другие данные, которые рецензент попросил сделать рукопись более полной.

Конкретных точек:

Чтобы предложить новую роль передачи сигналов Shh в качестве инструктивного сигнала для отбора специфических субпопуляций MNs, я полагаю, что авт. Д. Улучшить характеристики субпопуляций MN, экспрессирующих Shh.

1) В спинном мозге куриного эмбриона экспрессия Shh ранее описывалась в постмитотических мотонейронах LMC (на стадии Hh25), позднее распространяясь на MMC (стадия Hh45) (рис. 1 в Oppenheim et al., 1999). Однако Nam и cols в этой рукописи показывают экспрессию Shh, ограниченную нейронами LMC на уровне плеча. Выбранный раздел, показанный на Фигуре 1A, показывает экспрессию Shh, ограниченную mLMC (и исключенную из lLMC), а также исключенную из MMC. Могут ли авторы прояснить эти противоречивые вопросы?

Как предложил рецензент, мы повторно исследовали экспрессию Shh более тщательно с четко определенными маркерами для моторных столбцов у куриных эмбрионов (стадия Hh39) (рис. 1B).Наш анализ показывает, что Shh экспрессируется в LMCm (Isl1 ⁺ / FoxP1 ⁺ ), но не LMCl (Isl1 ^— / FoxP1 ⁺ ) на уровне плеча, и, что интересно, он выражается в LMCl (Isl1 ^— / FoxP1 ⁺ ) на уровне поясницы. Экспрессия Shh явно исключена из MMC (Lhx3 ⁺ MNs) на всех аксиальных уровнях, как продемонстрировано сходящимися анализами Lhx3 и Shh (Figure 1B). В целом, результаты нашего анализа экспрессии Shh очень похожи на данные в упомянутой статье (Oppenheim et al., 1999) [10], несмотря на незначительные различия, вероятно, из-за вариаций чувствительности обнаружения антисмысловых зондов Shh.

Oppenheim et al. показали хорошую экспрессию Shh у куриных эмбрионов на разных стадиях развития. На стадии Hh25 Shh экспрессируется в хорде и пластине дна, но не в постмитотических мотонейронах LMC (Figure 1A в Oppenheim et al. [10]), что похоже на то, что мы наблюдали. На стадии Hh33 обнаруживается низкий уровень Shh в брюшном роге (рис. 1C в Oppenheim et al.[10]), что может быть результатом более высокого уровня чувствительности антисмыслового зонда Shh. Оппенгейм и др. также описано, что на стадии Hh45 Shh экспрессируется в двух различных популяциях мотонейронов (MN) (медиальном и латеральном), и рефери 2 может называть эти медиальные MN как MMC. Однако эта Shh-экспрессирующая медиальная популяция MN, скорее всего, будет LMCm, судя по расположению клеточного тела. Трудно сделать вывод об идентичности моторных столбцов без анализа коэкспрессии с маркерами моторных столбцов. Таким образом, мы выполнили эти необходимые анализы коэкспрессии на рисунке 1B.

2) Панель B этого рисунка (экспрессия в эмбрионах мыши) не показывает эту ограниченную экспрессию для mLMC. Являются ли эти видовые различия специфическими? Или различия в стадиях развития?

Уровень экспрессии Shh в мотонейронах мышей намного ниже, чем в мотонейронах кур. Поскольку мы исследовали сравнимые стадии развития у эмбрионов мышей и кур, мы не думаем, что разница в уровнях экспрессии отражает различия в стадиях развития.Мы заметили, что общий анализ гибридизации in situ имеет тенденцию работать более эффективно на куриных эмбрионах, чем на эмбрионах мыши, не только для Shh, но и для многих других генов. Эти различия в чувствительности результатов гибридизации in situ могут отражать видовые различия, но нам еще предстоит понять, какие именно факторы способствуют этому наблюдению. Тем не менее, наши анализы на эмбрионах мышей и кур демонстрируют экспрессию Shh в постмитотических мотонейронах.

3) Должна быть предоставлена ​​детальная временно-пространственная экспрессия Shh в постмитотических МН.Их должно быть легко прояснить в сочетании с доступными и четко определенными маркерами для каждого столбца MN (см., Например, Adams et al., 2015)

Следуя совету рецензента, мы повторно исследовали экспрессию Shh более тщательно с четко определенными маркерами моторных столбцов у куриных эмбрионов (стадия Hh39) (Рисунок 1B). Наш анализ показывает, что Shh экспрессируется в LMCm (Isl1 ⁺ / FoxP1 ⁺ ), но не LMCl (Isl1 ^— / FoxP1 ⁺ ) на уровне плеча, и, что интересно, он выражается в LMCl (Isl1 ^— / FoxP1 ⁺ ) на уровне поясницы.Экспрессия Shh явно исключена из MMC (Lhx3 ⁺ MNs) на всех аксиальных уровнях, как продемонстрировано сходящимися анализами Lhx3 и Shh (Figure 1B).

Для анализа роли Shh в спецификации подтипа MN; Эксперименты с потерей функции NT куриных эмбрионов проводили с помощью электропорации на HH стадии 13 куриных эмбрионов (материалы и методы), при которых формирование паттерна NT не определенно установлено (см. например Cayuso et al., 2006).

4) Требуются контроли, показывающие количественную оценку потери Shh-, особенно потому, что дефекты оказались незначительными, несмотря на продолжительность экспериментов (96 часов после электропорации при Hh23).Например, эксперименты Gli-bs-luc, показывающие эффективность вектора Shh-LOF.

В исправленной рукописи мы количественно оценили интенсивность сигнала Shh ISH и подтвердили значительное снижение экспрессии Shh в двигательных нейронах (рис. 2C). Следует отметить, что в наших условиях электропорации эффективность электропорации клеток дна пластины обычно очень низкая, вероятно, из-за глубины и расположения электродов. Таким образом, мы ожидали, что нокдаун Shh будет наиболее эффективен в двигательных нейронах, но не в пластине пола, что позволило нам сосредоточиться на анализе влияния Shh-LOF на моторную столбчатую спецификацию без значительных изменений пролиферации предшественников или раннего формирования паттерна нервной трубки. .Наш анализ, включая тщательную количественную оценку, действительно показал, что нет значительных изменений в пролиферации (клетки BrdU ⁺ ) или формировании вентрального нервного паттерна (Olig2 ⁺ , Nkx2.2 ⁺ клетки на рис. 2A, C). Мы также обнаружили значительное сокращение мотонейронов LMCl (рис. 2B, C).

5) Более того, роль передачи сигналов Shh в пролиферации и выживании нейральных предшественников также хорошо известна, следовательно, необходим контроль, исключающий эти дефекты.

В пересмотренной рукописи мы предоставили данные включения BrdU для пролиферации и окрашивания расщепленной каспазой 3 для апоптотических клеток, и эти результаты не показывают значительных изменений в пролиферации и выживаемости нейральных предшественников (рис. 2A, C).

6) Контроли, показывающие маркеры предшественников, должны быть включены, чтобы исключить дефекты формирования паттерна.

Теперь мы предоставили данные, что вентральные клетки-предшественники устанавливаются должным образом путем окрашивания Olig2 и Nkx2.2, маркеры домена p2 и p3, соответственно, экспрессия которых зависит от уровней Shh в пластине дна (рис. 2A, C).

7) Я твердо верю, что для того, чтобы проанализировать специфическую роль передачи сигналов Shh в генерации постмитотического подтипа MN, необходимо провести эксперименты с использованием специфического для MN драйвера (например, хорошо охарактеризованного HB9), чтобы избежать дефектов формирования паттерна и пролиферации.

Мы уже пытались использовать Hb9-Cre для этой цели, но Hb9-Cre оказался проблематичным для наших экспериментов, потому что Hb9 экспрессируется (следовательно, Hb9-Cre активен) в хорде, которая секретирует Shh, необходимый для нервной системы. разработка трубки [5].Поскольку Hb9-Cre удаляет Shh в хорде и устраняет Shh, необходимый для формирования паттерна вентральной нервной трубки, удаление Shh с помощью Hb9-Cre, как ожидается, вызовет серьезные дефекты формирования паттерна и пролиферации в нервной трубке. Таким образом, Hb9-Cre нельзя использовать в нашем эксперименте. Чтобы обойти эту проблему, мы также использовали Isl1-Cre, экспрессия Cre которого происходит, когда моторные нейроны выходят из предков. Мы генерировали Shh-cKO с Isl1-Cre и обнаружили, что Shh-cKO; Isl1-Cre мыши имеют серьезные дефициты в развитии конечностей, поскольку Isl1-Cre инактивирует Shh в развивающейся конечности [2, 6, 7].Дефицит развития конечностей у Shh-cKO; Isl1-Cre составил наш анализ развития LMC, учитывая, что наблюдаемые дефекты мотонейронов LMC могут быть вторично вызваны тяжелыми дефектами развития конечностей. Таким образом, Hb9-Cre неадекватен для удаления Shh только в двигательных нейронах, а Olig2-Cre был лучшей линией, которую мы могли бы использовать для неактивного Shh в двигательных нейронах.

Чтобы дополнить анализ мышей Shh-cKO, мы также проанализировали куриные эмбрионы, у которых Shh сбивается в моторных нейронах, но не в пластине пола (рис. 2А).В наших экспериментах по электропорации цыплят эффективность электропорации клеток дна пластинки, как правило, очень низка, и все электропорированные клетки помечены GFP. Мы проанализировали куриные эмбрионы, которые не экспрессируют GFP на дне чашки (следовательно, не инактивируют Shh), что дополнительно подтверждено гибридизационным анализом экспрессии Shh in situ. Наши данные показывают, что у проанализированных куриных эмбрионов пролиферация клеток является нормальной. Мы также исследовали вентральные маркеры предшественников, такие как Nkx2.2 и Olig2, экспрессия которых зависит от уровней Shh в пластине дна, чтобы дополнительно исследовать присутствие Shh в пластине дна.Эти строгие анализы исключают возможность того, что любые наблюдаемые фенотипы вызваны эффектом делеции Shh у предков.

8) Должны быть предоставлены количественные данные, указывающие общее количество MN по сравнению с конкретными MN подтипа. Важно понимать, изменили ли LMN свою судьбу, не генерируются ли LMN.

Теперь мы предоставили количественные данные для общего количества MN и MN, специфичных для подтипа, на Рисунке 2C.Нокдаун Shh приводил к сокращению мотонейронов LMC1, не затрагивая другие подтипы моторных столбов, и, следовательно, общее количество MN было уменьшено по сравнению с неинъектированной стороной (рис. 2С). Этот результат указывает на то, что двигательные нейроны LMC не генерируются или не поддерживаются должным образом, а не переключаются на другие подтипы MN в отсутствие Shh.

9) Количественные данные на рис. 1A, панель D показывают клетки FoxP1 +, это islet1 +? Или islet1-? То же самое для Hb9, эти анализы будут различать между 1LMB и mLMC.

Количественные данные на рисунке 1A, панель E показывает клетки Lhx3 +, то же самое для комбинации с дополнительным маркером для ограничения фенотипа конкретным подтипом MN

Теперь мы предоставили количественные данные для каждого столбца двигателя, такого как LMCl (Hb9 ⁺ / FoxP1 ⁺ или Isl1 ^— / FoxP1 ⁺ ), LMCm (Hb9 ^— / FoxP1 ⁺ 3 или Isl1 ^{или Isl1} ). + / FoxP1 ⁺ ), HMC (Hb9 ⁺ / Isl1 ⁺ ) и MMC (Lhx3 ⁺ / Hb9 ⁺ ) на рисунке 2C.

10) Схематическое изображение столбцов MN, включая маркеры и фенотип, будет большим подспорьем.

Мы включили схематический рисунок столбцов MN с маркерами и фенотипом на рис. 8D.

11) То же самое относится и к анализу мутантного фенотипа Shh-Olig2C. Эти эксперименты должны были быть выполнены с использованием драйвера, специфичного для MN (например, хорошо охарактеризованной линии HB9CRE, доступной в Jackson), чтобы избежать дефектов образования паттерна и распространения.

Мы выбрали драйвер Olig2-Cre для наших экспериментов с условным нокаутом, потому что предыдущая работа показала, что Olig2-Cre не удаляет ген в клетках пластинки дна [1, 11]. Shh в пластине пола необходим для формирования паттерна вентрального спинного мозга, продукции pMN клеток и генерации мотонейронов и вентральных интернейронов [4]. Таким образом, если Shh в пластине пола отсутствует или снижен у Shh-cKO; Olig2-Cre эмбрионов, мы ожидаем, что это приведет к полной потере или резкому снижению предшественников Olig2 ⁺ pMN, всех типов мотонейронов, и интернейроны V2.Однако не было существенной разницы в количестве предшественников Olig2 ⁺ pMN в проанализированных Shh-cKO; Olig2-Cre и контрольных эмбрионах, что позволяет предположить, что уровень Shh, секретируемый дном пластинки, был адекватен для формирования паттерна и продукции pMN. Мы включили данные количественной оценки количества клеток Olig2 ⁺ в Shh-cKO; Olig2-Cre и контрольных эмбрионах (рис. 3C). Мы также обнаружили, что только двигательные нейроны LMC FoxP1 ⁺ , включая LMCm и LMCl, но ни двигательные нейроны MMC (Lhx3 ⁺ Hb9 ⁺ ), ни двигательные нейроны HMC (Isl1 ⁺ Hb9 ⁺ ) не уменьшались у мышей Shh-cKO; Olig2-Cre (рис. 3C), что дополнительно указывает на то, что Shh, секретируемый из пластинки дна, был адекватен для управления формированием паттерна вентрального спинного мозга и продукции клеток pMN.

Также ознакомьтесь с нашим ответом на вопрос 7 о том, почему Hb9-Cre нельзя использовать для анализа Shh-cKO.

12) Укажите общее количество MN по сравнению с MN для конкретных подтипов. Пожалуйста, укажите, являются ли клетки FoxP1 + islet1 и Hb9 +/-.

Мы включили количественные данные для каждого столбца двигателя и общее количество MN на рис. 3C. Количество мотонейронов FoxP1 ⁺ LMC, включая как LMCm, так и LMCl, было уменьшено, но ни мотонейроны MMC (Lhx3 ⁺ Hb9 ⁺ ), ни Isl1 ⁺ Hb9 ⁺ мотонейроны HMC не были изменены в Shh. -cKO; Olig2-Cre мышей (рис. 3C), что приводит к снижению общего количества MN в Shh -cKO по сравнению с контрольными однопометниками.

Чтобы идентифицировать кандидатные эффекторные гены, авторы искали гены-мишени транскрипционного комплекса Isl1-Lhx3, ранее хорошо охарактеризованные этой группой. Какая связь между этой поисковой стратегией и передачей сигналов Shh, мне неясно, но они идентифицируют члена семейства Rho GAP Arhgap36, который, как известно, активирует транскрипционные ответы Gli посредством ингибирования активности PKA.

В то время как мы анализировали функцию Shh в столбчатой ​​спецификации, сообщалось, что ARHGAP36 активирует транскрипционные ответы Gli посредством ингибирования активности PKA.Мы исследовали паттерн экспрессии предполагаемых генов-мишеней комплекса Isl1-Lhx3 в развивающемся спинном мозге и обнаружили, что ARHGAP36 является одним из потенциальных генов MN, поскольку его экспрессия очень высока и специфична в MN.

13) Было бы неплохо увидеть среди множества генов, регулируемых транскрипционным комплексом Isl1-Lhx3, может ли существовать кластер компонентов передачи сигналов HH?

Мы не видим кластер компонентов передачи сигналов HH, регулируемых комплексом Isl1-Lhx3, кроме ARHGAP36.

14) Авторы идентифицируют HxRE гена Arhgap36 и тестируют активность in vivo с помощью экспериментов электропорации на NT куриного эмбриона. Пожалуйста, предоставьте количественные данные, указывающие количество проанализированных эмбрионов. Предоставьте количественные данные, указывающие на индуцирование эктопических клеток HB9. Пожалуйста, предоставьте временной ход электропорации, а также эксперименты с отрицательным контролем.

Мы предоставили количественные данные о количестве инъецированных эмбрионов и динамике электропорации в легенде к рисунку.Очень хорошо установлено, что электропорация Isl1 + Lhx3 индуцирует эктопические клетки Hb9 ⁺ в спинном мозге [12-14], и мы обычно проводим этот эксперимент в лаборатории. Из этой серии экспериментов мы хотели бы увидеть индукцию репортера GFP, управляемую Arghap36 -энхансером, активированным Isl1 + Lhx3 в спинном мозге. Действительно, мы смогли обнаружить очень хорошую экспрессию GFP, а также эктопические клетки Hb9 ⁺ в спинном мозге по экспрессии Isl1 + Lhx3.Мы включили данные подсчета эктопических клеток Hb9 ⁺ в спинном мозге (рис. 4F) и отрицательный контрольный эксперимент с векторной конструкцией TATA-GFP, которая не имеет HxRE и не активируется Isl1 + Lhx3 (рис. 4E).

15) Я считаю, что данные, представленные здесь, демонстрируют, что комплекса Isl1-Lhx3 достаточно для индукции экспрессии Arhgap36; является ли эта индукция прямой, полностью не продемонстрировано.

с использованием экстрактов спинного мозга мышей показал, что Isl1 и Lhx3 сильно рекрутируются в область энхансера Arhgap36 , но не в область отрицательного контроля Untr6 (рис. 4C), что указывает на индукцию Arhgap36 с помощью Isl1-Lhx3 комплекс действительно прямой.

Следующие авторы анализируют экспрессию Arhgap36 в постмитотических нейронах. Это важный вопрос, поскольку Shh может действовать паракринным или клеточно-автономным образом, чтобы инструктировать идентичность подтипа MN.

16) Пожалуйста, предоставьте лучшую характеристику Arhgap36 в подтипах MN (совместная локализация с маркерами подтипа MN) и совместная локализация (или нет) с Shh, с клеточным разрешением.

Теперь мы предоставили подробные данные экспрессии Arhgap36 в сочетании с определенными маркерами для каждого столбца MN, такими как Arhgap36 / Isl1 / FoxP1, Arhgap36 / Isl1 / Hb9 и Arhgap36 / Lhx3 / Hb9 (в эмбрионах мыши Рисунок 5C). Arhgap36 наиболее высоко экспрессируется в области LMC1 (Isl1 ^— / FoxP1 ⁺ ), немного в MMC-ромбовидной мышце (Hb9 ⁺ / Lhx3 ^low ) и очень мало в самой медиальной части MMC, но не в LMCm (Isl1 ⁺ / FoxP1 ⁺ ) на шейном уровне. На грудном уровне Arhgap36 также экспрессируется в MN PGC (FoxP1 ⁺ / Isl1 ⁺ ) и HMC (Isl1 ⁺ / Hb9 ⁺ ), хотя уровень экспрессии относительно ниже.На поясничном уровне Arhgap36 относительно высоко обогащен LMCl (Isl1 ^— / FoxP1 ⁺ ) и показывает очень низкий уровень в самой медиальной части MMC. Чтобы изучить совместную локализацию Arhgap36 с Shh, мы выполнили in situ гибридизацию Shh и IHC Arhgap36 в спинном мозге мыши E12.5 на шейном уровне. Shh совместно локализуется с Arhgap36 в основном в области LMCl (рис. 5D).

Таким образом, Shh мыши в основном экспрессируется в LMCl спинного мозга мыши, который локализован совместно с Arhgap36 , тогда как Shh цыпленка экспрессируется в LMCm на шейном уровне и LMCl на поясничном уровне спинного мозга цыплят, где цыпленок Arhgap36 широко выражен в спинном мозге.Хотя существует несоответствие в паттернах экспрессии Shh в спинном мозге мышей и кур, Arhgap36 , по-видимому, коэкспрессируется с Shh у обоих видов, и регуляторная ось Shh-ARHGAP36 все еще может функционировать как в спинном мозге мышей, так и кур.

17) Предоставьте данные об экспрессии Arhgap36 в MN куриных эмбрионов. Было бы интересно увидеть сохранение его выражения в MN.

Гибридизация цыплят Arhgap36 in situ показала довольно широкую, но специфическую и высокую экспрессию в спинном мозге по сравнению с другими тканями куриного эмбриона (фиг. 7 — приложение к фиг. 3).

Следующие авторы проверяют, активируется ли Shh-путь при сверхэкспрессии Arhgap36. Эксперименты на NT куриного эмбриона проводили путем электропорации ARHGAP36 на куриных эмбрионах HH стадии 13 (материалы и методы). Эти эксперименты по увеличению функции вызывают избыточный рост NT, соответствующий чрезмерной активации передачи сигналов Shh, в дополнение к вентрализации всего NT. Количественные данные, указывающие на отсутствие количества проанализированных эмбрионов, время электропорации, должны быть предоставлены, а также количественная оценка маркерных эктопических клеток.

Мы предоставили количественные данные о количестве инъецированных эмбрионов, динамике электропорации в легенде к рисунку и включили количественные данные для нейронов FoxP1 ⁺ LMC и MMC (Lhx3 ⁺ / Hb9 ⁺ ) (Рисунок 6B).

18) Я считаю, что эти эксперименты контролируют способность ARHGAP36 активировать Shh-опосредованные ответы in vivo . Поскольку это ранее было задокументировано в других системах, эти эксперименты могут использоваться в качестве дополнительной информации.

Мы переместили эти данные в дополнительную информацию (Рисунок 6 — Приложение 1 к рисунку).

19) Авторы утверждают, что сверхэкспрессия ARHGAP36 в вентральном NT, собранном при 4 днях рождения, резко увеличила количество FoxP1 + LMC нейронов, что позволяет предположить, что ARHGAP36 достаточен для определения судьбы LMC. Опять же, я считаю, что эти эксперименты должны были быть выполнены с использованием специфического драйвера MN HB9, чтобы избежать дефектов формирования паттерна и распространения. При нынешнем дизайне эксперимента очень трудно определить прямую роль ARHGAP36 в отборе постмитотических субпопуляций MN, кроме роли в предшественниках MN

.

Мы использовали систему Gal4 / UAS для управления специфической экспрессией мотонейрона Arhgap36 .Мы создали конструкцию Hb9-Gal4, в которой домен трансактивации связывания ДНК Gal4 экспрессируется под действием промотора Hb9, специфичного для двигательных нейронов, и конструкции UAS- Arhgap36 , где Arhgap36 экспрессируется посредством связывания Gal4 с элементом ответа UAS. Используя эту систему, мы могли направить экспрессию Arhgap36 в постмитотические MN, и этот эксперимент также привел к специфическому увеличению FoxP1 ⁺ LMC нейронов, но не оказал никакого влияния на нейроны MMC (Lhx3 ⁺ / Hb9 ⁺ ). (Рисунок 6).

И снова в этих экспериментах требуются количественные данные, указывающие на количество проанализированных эмбрионов, временной ход электропорации отсутствует. Должна быть предоставлена ​​количественная оценка маркерных эктопических клеток.

Теперь мы предоставили количественные данные о количестве эмбрионов в легенде рисунка и данные количественной оценки для маркеров ⁺ номеров клеток на Рисунке 6.

Далее авторы показывают, что активность PKA ингибируется с помощью ARHGAP36. Однако это наблюдение не ново, поскольку Eccles et al.(2016) показали, что ARHGAP36 сочетает в себе два различных механизма ингибирования для противодействия передаче сигналов PKA; он блокирует каталитическую активность PKA и нацелен на PKAc для опосредованной убиквитином деградации, что приводит к активации пути Shh.

20) Я не вижу смысла анализировать другие цели, кроме PKA, в контексте спецификации MN, поэтому я считаю, что панели C, D, E на рисунке 5 не имеют отношения к этому контексту.

Мы переместили эти данные в дополнительные цифры (Рисунок 6 — Приложение 1 к рисунку).

21) Снова, в контексте передачи сигналов Shh / ARHGAP36 в выборе подтипа MN, я не вижу релевантности экспериментов AKT, показанных на рис. 6. Я считаю, что это должно быть удалено.

Кроме того, Zhang et al. (2019) обнаружили, что Patched1 взаимодействует с ArhGAP36 в центросоме и стабилизирует отрицательный регулятор PKA (эту статью следует процитировать в рукописи).

Zhang et al., Ось Patched1-ArhGAP36-PKA-Inversin определяет цилиарную транслокацию Smoothened для активации пути Sonic Hedgehog.Proc Natl Acad Sci U S A. 2019, 15 января; 116 (3): 874-879

Мы цитировали эту статью во введении. Поскольку путь Shh играет критическую роль в эмбриональном развитии, тканевом гомеостазе и онкогенезе, важно определить регуляторную сеть, модулирующую множество компонентов, участвующих в этом пути. Мы обнаружили, что AKT стабилизирует уровень белка Arhgpa36 и дополнительно усиливает активность Shh в генерации подтипа MN, что является довольно новым, и эта регуляторная ось может широко участвовать в различных Shh-зависимых состояниях.

22) Авторы показывают сниженную экспрессию ARHGAP36 у мышей Shh-KO (фиг. S4), опять же без каких-либо количественных данных.

Мы предоставили количественные данные (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1).

Наконец, авторы создают мутантных мышей ARHGAP36. Авторы утверждают, что на ранних стадиях развития дефекта в генерации MN не было. Необходимо предоставить количественные данные по этому контрольному наблюдению.

Мы включили данные, показывающие отсутствие дефекта пролиферации (BrdU), формирования вентрального нейрального паттерна (Nkx2.2, Olig2) и общее образование MN (Hb9) на E11.5 и предоставили количественные данные на рисунке 8 — приложение к рисунку 1.

23) Анализ фенотипа, генерируемого мутантом ARHGAP36_CRISPR в MN на плечевом и грудном уровнях развивающегося спинного мозга, снова требует количественных данных, указывающих на то, что общее количество MN не изменилось на грудном уровне.

Мы включили количественные данные HMC (Hb9 ⁺ / Isl1 ⁺ ), MMC (Lhx3 ⁺ / Hb9 ⁺ ), PGC (nNOS ⁺ ) и общее количество MN на грудном уровне (рис. 8С).

24) Количественные данные, указывающие на то, что общее количество MMC и общее количество интернейронов V2 не изменились на уровне плеч.

Мы включили количественные данные MMC (Lhx3 ⁺ / Hb9 ⁺ ) и V2-IN (Chx10 ⁺ / Lhx3 ⁺ ) на уровне плеч (рис. 8C).

25) Должны быть предоставлены количественные данные, указывающие общее количество MN в сравнении с MN конкретных подтипов. Важно понять, изменили ли LMN в отсутствие ARHGAP36 свою судьбу, не генерируются ли LMN.

Мы включили количественные данные LMCm (Isl1 ⁺ / FoxP1 ⁺ ), LMCl (Hb9 ⁺ / FoxP1 ⁺ , Lhx1 ⁺ / FoxP1 ⁺ ), HMC + ), HMC + Isl1 ⁺ ), MMC (Lhx3 ⁺ / Hb9 ⁺ ) на плечевом и грудном уровнях (Рисунок 8C). У мышей Arhgap36 KO, FoxP1 ⁺ LMC, включая нейроны LMCm и LMCl, уменьшились, в то время как не было компенсаторного увеличения мотонейронов не-LMC типа, которые мы исследовали, и затем в результате это приводит к снижению общего количества MN ( Рисунок 8C).Увеличение количества активных клеток Caspase3 ⁺ в области двигательных нейронов мышей Arhgap36 KO (фиг. 8 — приложение к рисунку 1) предполагает, что предполагаемые нейроны LMC претерпевают апоптотическую гибель клеток в отсутствие Arhgap36 . Однако остается неясным, является ли гибель клеток прямым результатом потери Arhgap36 , способствующей выживанию клеток, или косвенным результатом неудачи в получении или поддержании правильной идентичности LMC. Важно отметить, что предыдущие исследования показали, что спецификация судьбы постмитотических мотонейронов и их выживаемость тесно связаны и трудно различить фенотипы между спецификацией судьбы и выживанием постмитотических мотонейронов.После выхода из клеточного цикла «общие» двигательные нейроны диверсифицируются на отдельные подтипы двигательных нейронов, включая LMC. Передача сигналов ретиноевой кислоты (RA) играет роль в спецификации и поддержании идентичности LMC передних конечностей [15-21]. Потеря RA из моторных нейронов приводит к уменьшению количества нейронов LMC без значительного изменения количества нейронов MMC [21], как и у наших эмбрионов Arhgap36 KO. Эктопическая активация передачи сигналов RA в грудных мотонейронах нарушает дифференцировку мотонейронов не-LMC типа и в конечном итоге запускает апоптотическую гибель клеток [19].Один потенциальный механизм, который связывает спецификацию судьбы и выживаемость клеток, заключается в том, что двигательные нейроны, которые не приобрели правильную клеточную идентичность, неспособны принимать полученные от мишени нейротрофические сигналы.

Артикул:

1) Dessaud, E., et al., Интерпретация градиента морфогена sonic hedgehog с помощью механизма временной адаптации. Nature, 2007. 450 (7170): с. 717-20.

2) Harfe, B.D., et al., Доказательства основанного на расширении временного градиента Shh при определении идентичности пальцев позвоночных.Cell, 2004. 118 (4): p. 517-28.

3) Варадараджан, С.Г. и др., Нетрин1, продуцируемый нейронными предшественниками, а не клетками пластинки пола, необходим для наведения аксонов в спинном мозге. Нейрон, 2017. 94 (4): с. 790-799.e3.

4) Джессел Т.М. Спецификация нейронов спинного мозга: индуктивные сигналы и транскрипционные коды. Nat Rev Genet, 2000. 1 (1): p. 20-9.

5) Харрисон К.А. и др., Агенез дорсальной доли поджелудочной железы и аномальные островки Лангерганса у Hlxb9-дефицитных мышей.Nat Genet, 1999. 23 (1): p. 71-5.

6) Yang, L., et al., Isl1Cre обнаруживает общий путь Bmp в развитии сердца и конечностей. Развитие, 2006. 133 (8): с. 1575-85.

7) Itou, J., et al., Islet1 регулирует формирование поля задней задней конечности выше сети морфорегулирующих генов Hand2-Shh у эмбрионов мыши. Разработка, 2012. 139 (9): с. 1620-9.

8) Kanda, S., et al., Sonic hedgehog индуцирует капиллярный морфогенез эндотелиальными клетками через фосфоинозитид-3-киназу.J Biol Chem, 2003. 278 (10): стр. 8244-9.

9) Riobo, N.A., et al., Фосфоинозитид-3-киназа и Akt необходимы для передачи сигналов Sonic Hedgehog. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103 (12): p. 4505-10.

10) Оппенгейм, Р. В. и др., Модуляция ранних, но не более поздних стадий запрограммированной гибели клеток в спинном мозге эмбрионов птиц с помощью звукового ежа. Mol Cell Neurosci, 1999. 13 (5): p. 348-61.

11) Sagner, A., et al., Регуляторная динамика Olig2 и Hes во время дифференцировки моторных нейронов, выявленная с помощью транскриптомики одиночных клеток.ПЛоС Биол, 2018. 16 (2): с. e2003127.

12) Thaler, J.P., et al., LIM-фактор Lhx3 вносит вклад в спецификацию идентичности моторных нейронов и интернейронов посредством специфичных для клеточного типа белок-белковых взаимодействий. Cell, 2002. 110 (2): с. 237-49.

13) Lee, S., et al., STAT3 способствует дифференцировке двигательных нейронов за счет взаимодействия со специфическим для двигательных нейронов комплексом LIM. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110 (28): с. 11445-50.

14) Cho, H.H., et al., Isl1 напрямую контролирует холинергическую нейрональную идентичность в развивающемся переднем и спинном мозге, образуя комплексы, специфичные для определенного типа клеток.PLoS Genet, 2014. 10 (4): с. e1004280.

15) Соканатан, С. и Т.М. Джесселл, Передача сигналов ретиноидов, полученных из моторных нейронов, определяет подтипную идентичность спинномозговых мотонейронов. Cell, 1998. 94 (4): p. 503-14.

16) Соломин, Л. и др., Передача сигналов рецептора ретиноида-X в развивающемся спинном мозге. Nature, 1998. 395 (6700): с. 398-402.

17) Diez del Corral, R., et al., Противоположные FGF и ретиноидные пути контролируют вентральный нервный паттерн, дифференцировку нейронов и сегментацию во время вытягивания оси тела.Нейрон, 2003. 40 (1): с. 65-79.

18) Novitch, B.G., et al., Необходимость в опосредованной ретиноевой кислотой транскрипционной активации в формировании вентрального нейрального паттерна и спецификации мотонейронов. Нейрон, 2003. 40 (1): с. 81-95.

19) Sockanathan, S., T. Perlmann, T.M. Джесселл, Передача сигналов ретиноидных рецепторов в постмитотических мотонейронах регулирует рострокаудальную позиционную идентичность и паттерн проекции аксонов. Нейрон, 2003. 40 (1): с. 97-111.

20) Vermot, J., et al., Ретинальдегиддегидрогеназа 2 и Hoxc8 необходимы в плечевом спинном мозге мышей для спецификации мотонейронов Lim1 + и правильного распределения мотонейронов Islet1 +.Развитие, 2005. 132 (7): с. 1611-21.

21) Ji, S.J., et al., Мезодермальные и нейрональные ретиноиды регулируют индукцию и поддержание конечностей, иннервирующих спинномозговые мотонейроны.