Тсс панели что это: Плита ТSS | Полезные советы от мебельной фабрики Стайвер-100

Плита ТSS | Полезные советы от мебельной фабрики Стайвер-100

Компания Стайвер-100 регулярно совершенствует технологии производства мебели на заказ и обновляет список материалов, используемых для изготовления своей продукции. Благодаря этому мы можем предложить клиентам современные модели кухонь, шкафов-купе и другой корпусной мебели, которые характеризуются высокой функциональностью, долговечностью и превосходными эстетическими данными. Кроме того, такой подход позволяет удовлетворить желание заказчиков в приобретении новейших образцов мебели, которая не утратит своей «современности» в течение всего срока эксплуатации.

Сравнительно недавно на рынке России появилась плита TSS Cleaf, существенно улучшающая эстетические и эксплуатационные характеристики мебели. Данный материал представляет собой основу из МДФ либо ДСП, одна или две стороны которой покрыта особым слоистым пластиком, создающим достоверный 3D-эффект. Эта новинка значительно привлекательнее ЛДСП и практичнее натурального шпона, благодаря чему ее популярность среди покупателей и производителей мебели «растет не по дням, а по часам». Плита ТСС – термоструктурированный материал с ярко выраженной поверхностью, имитирующей ткани, древесину и волнообразный рельеф. Это новое поколение плит, используемых для изготовления раздвижных и распашных фасадов, мебельных корпусов, а также отделки стен во внутренних помещениях. Данный материал имеет не только широкую область применения, но и ряд важных достоинств: 

  • уникальное неповторимое сочетание тактильных и визуальных эффектов;
  • поразительная стойкость к истиранию и исцарапыванию декоративной поверхности;
  • невосприимчивость к воздействию высоких температур;
  • предельно низкое содержание вредных веществ, делающее материал безопасным для здоровья людей и животных;
  • высокая устойчивость TSS-плиты к воздействию УФ-излучения;
  • простота ухода за декоративной поверхностью и неуязвимость покрытия перед агрессивными химическими соединениями, в том числе и эффективными моющими средствами, удаляющими стойкие загрязнения.

Плита TSS производится итальянской компанией Cleaf, которая приобрела всемирную известность благодаря способности своих сотрудников воплощать в реальность самые смелые дизайнерские проекты. Вся продукция Cleaf – это совокупность высоких технологий, смелого дизайна и инноваций, подкрепленных авторитетной исследовательской базой. Итальянская компания проводит гармоничный и оригинальный синтез между хроматическими, тактильными и формальными эффектами, что позволяет создавать продукцию экстра-класса.

Инженеры компании Cleaf разработали запатентованные технологии обработки поверхностного материала, которые обеспечивают TSS плитам максимальное сходство не только с натуральной древесиной, но и тканями, камнем, а также кожей. Благодаря натуралистичности поверхность этого материала трудно отличить от природных аналогов.

Основные характеристики TSS плит

TSS плиты выпускаются в листах с габаритами 2800х2070 мм. Они имеют толщину 8 или 18 миллиметров, что расширяет область их применения и делает возможным использование в качестве вставок для рамочных фасадов из алюминиевого либо МДФ профиля. Поверхность листов имеет ярко выраженную вертикальную либо фантазийную структуру, благодаря которой и создается достоверный 3D эффект. Коллекция TSS плит пока насчитывает 35 декоров, подходящих для производства мебели в любом стиле. При этом компания Cleaf работает над созданием новых поверхностей, которые расширят возможности дизайнеров.

Ассортимент плит ТSS

Коллекция THERMO STRUCTURED SURFACES плит состоит из 10 отдельных серий, каждая из которых насчитывает разное количество декоров. Большинство плит имеет структурированный рисунок только на лицевой поверхности, а тыльная сторона вскрыта гладким пластиком с таким же точно декором. Исключением является серия Penelope, листы которой имеют 2-стороннюю объемную текстуру. При этом каждая из серий TSS-плит по-своему уникальна:

PENELOPE – плиты, поверхность которых имитирует структуру натуральных тканей. Нейтральная цветовая гамма делает этот материал пригодным для создания мебели любой стилистической направленности. Изделия из плит данной серии смотрятся гармонично и респектабельно в лаконичных интерьерах.

YOSEMITE – поверхность, достоверно имитирующая структуру древесины грубой обработки. Трехмерный рельеф плиты одинаково хорошо смотрится как в светлом, так и темном вариантах исполнения. Материал подходит для изготовления шкафов, перегородок, а также дверных полотен. Мебель из панелей YOSEMITE выглядит аристократично и монументально.

TRANCHE — очень интересное декоративное покрытие, изменяющее тона основного цвета в зависимости от интенсивности и направления световых потоков. Мягкий тактильный и визуальный эффект, создаваемый данным декором, великолепно подходит для интерьеров в стиле кантри.

ENGADINA – реалистичная имитация массива сосны с четко обозначенными рельефом, характерным для состаренной древесины. Эта натуралистичная копия необработанного спила сосны подходит для реализации неординарных дизайнерских идей.

SHANGHAI – минималистический геометрический рисунок, который чаще всего используется для создания восточного стиля в интерьере. Пересечение структурных линий на декоративной поверхности создает впечатление элегантности и изысканности.

SHERWOOD – предельно достоверная имитация поверхностно обработанной древесины ценных пород . Такие плиты отлично подходят для изготовления мебели в популярном стиле «Эко». Аутентичный рельеф декоративных покрытий придает плитам благородный богатый вид. SURF – плиты, текстура которых напоминает едва заметные и плавные морские волны. Спокойные цвета и относительно гладкий рельеф добавляют сдержанности и изысканности декоративным покрытиям этой серии. Такая 3D структура хорошо подходит для создания моделей в стиле «Модерн».

SPIGATO – серия, имитирующая твидовую ткань. Поверхность плит имеет оригинальный рельеф со своеобразным геометрическим узором, обеспечивающим неординарность этого декоративного покрытия. Серия SPIGATO помогает «освежить» дизайн и уйти от обыденности в интерьере.

MILLENNIUM – панели с динамичной рельефной структурой, имитирующей грубо обработанное дерево с последующей окраской. TSS плиты серии MILLENNIUM оригинально смотрятся при игре света и отличаются выразительностью и благородством. Подходят для создания мебели в любом стиле, пользуясь заслуженной популярностью у клиентов. Особенно удачно удается воссоздать с помощью этих панелей ретро-элементы интерьера.

SCULTURA – плита, более всего подходящая для изготовления мебели в японском стиле. Глубина древесного рисунка декоративной поверхности этих панелей подчеркивается за счет ярко выраженных бороздок, а также при помощи игры теней и света. Помимо японского стиля ТСС плита SCULTURA может быть задействована для оформления интерьеров в стиле модерн.

Преимущества фасадов TSS

Фасады – это важная часть мебели. Для надежности и долговечности кухонного гарнитура необходимо выбирать качественные и прочные фасады. Лучшими конструктивно — отделочными материалами, на сегодняшний день, считаются панели TSS.

Фасады TSS — это современные панели, выполненные из экологичных материалов, которые изготавливают особым методом прессования нескольких слоев пластика на древесные плиты.

Особенностью данного продукта является тиснение в образе волн, шахмат либо иных дизайнерских решений и пожеланий. Такие виды поверхностей считаются уникальными, и не имеют аналогов европейского производства.

Составляющими плит являются ДСП или МДФ. Для фасадов данного типа могут использоваться три вида облицовки:

  • двусторонняя;
  • односторонняя;
  • структурированная (заглаженные с одной стороны поверхности, финиш — пленка в оттенок с другой).

Производство, отличия и применение плит TSS

Основные особенности производства:

  1. Основание в виде плит из МДФ, ДСП или фанеры.
  2. Толщина слоя поверхности составляет не более 1.7 мм.
  3. Пропитка аналогична той, что применяется при изготовлении HPL пластика.
  4. Верхний слой поверхности состоит из пропитанной бумаги «меламин фильм», которая широко применяется для декора.
  5. Наличие от 3 до 6 слоев, в зависимости от необходимого типа структуры поверхности.
  6. Облицовка, состоящая из множества слоев специально пропитанной «крафт — бумаги».
  7. Технология прессования на специализированных плитах под высоким давлением.
  8. Спекание имеющихся слоев в целостную плиту, путем использования высоких температур и давления.
  9. При отдельных типах отделки возможна синхронизация рисунка тиснения с любым декоративным изображением, происходит перед прессованием.

Данная технология изготовления плит TSS разработана совсем недавно. Благодаря ей, появилась возможность создавать глубокие типы тиснений с использованием техники изготовления декоративных бумажно-слоистых пластиков.

Такая технология производства дает возможность приобретать конечному изделию отличительные свойства — износостойкость, глубокую структуру поверхности, высокую сопротивляемость к внешним негативным воздействиям.

Использование плит TSS довольно популярно не только при производстве фасадов, но и применяется для:

  • дверей — купе;
  • корпусной мебели;
  • предметов интерьера для гостиниц;
  • внутренней отделки помещений.

Преимущества и превосходства плит TSS

Основными потребительскими свойствами, благодаря которым эти плиты приобрели широкую популярность, являются:

  1. Неподверженность к пыли и грязи.
  2. Сохранение цвета независимо от прямого солнечного воздействия.
  3. Экологическая чистота и безопасность в пользовании.
  4. Высокая устойчивость к высоким температурам, истиранию и царапинам.
  5. Стойкость к воздействиям кислотных и различных химических веществ.

Многочисленные достоинства плит:

  1. Экологическая чистота.
  2. Приятные тактильные ощущения.
  3. Глубокое тиснение — до 250 МКМ.
  4. Уникальный, оригинальный дизайн.
  5. Увеличенная толщина слоя поверхности.
  6. Возможность синхронизированных декоров с 3D изображением.
  7. Ударопрочность, стойкость к деформации и внешним воздействиям.

Компания «Кухни Наб» предоставляет широкий ассортимент кухонь с различными фасадами, на любой вкус. Наша компания является лидером на рынке изготовления мебели в Королеве и Щелково. Благодаря профессионализму наших мастеров и применению всех современных технологий и инноваций в сфере производства мебели, мы гарантируем высокое качество, надежность и долговечность изготовляемой продукции.

Приобрести мебель от компании «Кухни Наб» можно по любому из указанных адресов:

  • г. Щёлково-7, ул. Браварская, 1А; ТЦ «Городок»;
  • г. Щелково, ул. Талсинская, 59; Салон «Модерн»;
  • г. Королёв, проспект Космонавтов, 34Б; ТЦ «Юпитер», пав.No 24 (цокольный этаж).

Мебельные фасады: видео

Примеры мебельных фасадов:

 

Плита ТSS – новая технология в производстве корпусной мебели!

Компания АртМастер постоянно расширяет ассортимент своей продукции и применяет для изготовления мебели новейшие технологии и материалы. Это помогает удовлетворить все запросы наших заказчиков и предложить им не просто качественную, а комфортную и стильную мебель, способную прослужить долгие годы.

Кухонные гарнитуры, шкафы-купе и другая корпусная мебель на заказ в Севастополе отличается долговечностью и практичностью в использовании. В течение всего срока эксплуатации такая мебель будет радовать хозяев функциональностью, и удивлять гостей ярким, современным дизайном.

Плита TSS Cleaf – одна из новинок российского рынка, которая способно заметно улучшить внешний вид и эксплуатационные характеристики мебели. Этот материал состоит из основы МДФ или ДСП, внешняя сторона которой покрыта специальным цветным пластиком. Покрытие имеет многослойную структуру и создает интересные 3D-эффекты.

Мебель, при изготовлении которой применяется плита ТSS выглядит гораздо интереснее, чем обычное ЛДСП, и отличается практичностью по сравнению с натуральным деревянным шпоном. Эти характеристики влияют на популярность материала, которая с каждым днем становится все больше среди производителей и покупателей мебели.

Структурированный при помощи высокой температуры материал, из которого  состоит плита ТСС, имеет яркую, глубокую текстуру. Он может достоверно  имитировать натуральное дерево, ткань и другие материалы, а также иметь абстрактный волнообразный дизайн. Этот материал используют для различных целей: изготовления дверей, фасадов, корпусов мебели, а также декоративного оформления стен.

Достоинства плит TSS неоспоримы. Это:

  • Необычные визуальные эффекты
  • Приятная на ощупь поверхность
  • Устойчивость к различного рода механическим повреждениям
  • Температурная стойкость
  • Минимальное количество вредных для здоровья людей и окружающей среды веществ
  • Невосприимчивость к солнечным лучам и влажности
  • Простота в эксплуатации и отсутствие реакции на химически активные моющие средства

Производит плиты TSS итальянская компания Cleaf. Эта всемирно известная фирма отличается передовыми разработками в сфере мебельного дизайна. Продукция Cleaf – это сочетание смелых идей и самых новейших технологий. Итальянский производитель имеет собственную исследовательскую лабораторию, где и происходят потрясающие открытия. Оригинальное совмещение необычных тактильных и визуальных ощущений, а также самое высокое качество материалов, позволяет создавать продукцию высокого премиум-класса.

Разработчики материала запатентовали изобретение плит ТСС, которые обладают уникальной способностью передавать фактуру дерева, кожи, камня и других материалов. Имитация настолько достоверна, что ее сложно отличить от природного материала. Эта технология является уникальной, которую не предлагает ни один другой производитель.

Особенности TSS плит:

  • Размер изделия составляет 2800х2070 мм при толщине 8 и 18 мм. Такие габариты дают возможность использовать листы как материал для цветных вставок в рамочных фасадах из алюминиевого профиля либо МДФ.
  • Поверхность плит отличается ярко выраженной декоративностью и чаще всего имеет вертикальную направленность рисунка, которая создает яркий 3D эффект
  • В коллекции TSS плит есть 35 вариантов рисунка, но производитель постоянно добавляет новые мотивы, чтоб расширить дизайнерские возможности материала.

Разнообразие плит ТSS

Коллекция термоструктурированных поверхностей состоит из 10-ти различных тем. Каждая серия имитирует различную структуру и может содержать несколько вариантов декора. Чаще всего 3D эффект присутствует только на лицевой части панели, а ее обратная сторона повторяет тот же рисунок на гладком пластике. Только серия Penelope отличается наличием объемного изображения на обеих сторонах полотна.

Каждая серия плит по-своему интересна и привлекательна:

  1. PENELOPE – поверхность напоминает натуральный камень. Ее благородные оттенки станут прекрасным дополнением практически к любому интерьеру и стилистическому направлению. Особенно гармонично такие плиты выглядят в лаконичных решениях минимализма.
  2. YOSEMITE – имитирует структуру грубо обработанного дерева. Этот дизайн интересно выглядит как в темном, так и светлом тоне. Трехмерный рельеф идеально подходит для внешних панелей шкафов и перегородок. Он придает интерьеру особую теплоту, и может применяться как в спальне и гостиной, так и на кухне.
  3. TRANCHE – панели отличаются тем, что способны изменять свой основной оттенок, в зависимости от угла падения света и его источника. Серию TRANCHE характеризует особо мягкое внутреннее свечение, которое невольно обращает на себя внимание и заставляет прикоснуться к поверхности. Мягкость и бархатистость этого покрытия прекрасно подходит для дизайна в стиле кантри.
  4. ENGADINA – необычные дизайнерские идеи можно воплотить в жизнь с помощью реалистичной имитации структуры сосны. Ярко выраженный рельеф, напоминающий состаренное дерево, используют как дополнение к популярному экостилю и стилю лофт. Разнообразие оттенков позволяет выбрать вариант, максимально дополняющий дизайнерскую задумку, а отличные эксплуатационные характеристики гарантируют долговечность изделия.
  5. SHANGHAI – элегантный и лаконичный рисунок из перекрещивающихся линий создает особую гармонию в помещении. Этот вариант TSS плиты прекрасно смотрится в помещениях в восточном стиле. Благодаря своей уникальной структуре он придает комнате изысканность и создает приятную атмосферу спокойствия. Эти плиты часто выбирают не только для создания мебели, но и для декоративного оформления стен и перегородок,
  6. SHERWOOD – также имитирует древесину, только с фактурой ценных пород. Трехмерное изображение делает поверхность максимально приближенной к натуральной, поэтому такие плиты наиболее часто применяют для оформления комнаты в популярном экостиле. Плиты SHERWOOD имеют ярко выраженную глубокую фактуру. Поверхности представлены в разнообразной цветовой палитре от черного до светло-бежевого и белого цвета, что позволяет комбинировать их с другими оттенками и материалами.
  7. SURF – имеет оригинальную структуру, напоминающую морские волны. Плавные переливы цвета создают едва заметное движение и невольно привлекают к себе взгляд. Гармоничная палитра подходит для изысканных интерьеров, привнося в помещение спокойствие. Эта 3D-поверхность хорошо подходит для создания мебели в стиле модерн.
  8. SPIGATO – интересная фактура, напоминающая плотную ткань. Поверхность плиты имеет мелкие рельефные полоски, не пересекающиеся между собой, что создает ощущение мягкости натуральной ткани. Плиты SPIGATO очень необычно смотрятся в интерьере и способны привнести в него интересную изюминку.
  9. MILLENNIUM – плиты этой серии имеют более крупный рисунок. Их поверхность выглядит как некрашеный спил дерева, и красиво смотрится при боковом освещении. Глубокий рельеф поверхности подходит для мебели в любом стиле и отлично сочетается с самыми различными материалами. Безупречный внешний вид и универсальность плит Миллениум делает их чрезвычайно популярными среди покупателей.
  10. SCULTURA – отличается ярко выраженными продольными бороздками и глубоким внутренним свечением. Плиты применяют для изготовления мебели в восточном стиле, а также для дизайна модерн. Игра света и тени создает непередаваемый эффект объема, и переливается несколькими оттенками под разным углом зрения.
comments powered by HyperComments

TSS

Для производств стильной современной мебели, дизайнеры с удовольствием пользуются достижениями технического прогресса. Одним из ноу-хау, которое позволило создавать изысканные и оригинальные решения в мебели и интерьере, стали итальянские плиты TSS Cleaf. Это идеальный материал, который создатели наделили возможностью имитации различных текстур.

Эти панели предназначены не только для изготовления фасадов или шкафов-купе. Из них можно сделать любую обстановку, которая всегда будет выглядеть дорого и оригинально. Не бойтесь экспериментировать применяя необычные, но качественные и эффектные материалы в своём доме, офисе или на при создании мебели.

TSS от CLEAF — компания, которая задаёт тренды

TSS Cleaf создаются одноименной компанией Cleaf, которая имеет итальянские корни и располагается на Апеннинском полуострове. Годом её основания является 1975, когда Лучано Каспани совместно со своим братом Фаусто и отцом Агостино основали компанию по поставкам поверхностей для производства мебели и элементов интерьера. Их имена и фамилия и стали основой для названия, которое сегодня известно во всём мире.

Но амбиции родственников были куда серьёзнее, нежели торговля. Страсть к мебели и желание представлять на рынке высококлассный продукт не похожий на другие, привели к тому, что в 1990 году, ими была куплена первая установка для имплантации панелей. Таким образом из торговой, Cleaf стала производственной компанией.

Первыми они начали выпускать облицовочные клиф панели, затем появились подразделения по производству ламината, кромок, заготовок для элементов мебели. Производства компании располагаются исключительно в провинции Брианц. На 4 фабриках трудится более 200 человек. А покупают продукцию дизайнеры и мебельные предприятия по всему миру. Кухни TSS стали знаком качества и стиля своих владельцев.

Компания всегда была новатором и идёт по выбранному пути и сейчас, постоянно расширяя своё производство и применяя самые передовые технологии. Известность Cleaf приобрела благодаря смелым решениям своих дизайнеров, которые не боялись их внедрять в свою продукцию. Cleaf предлагает решения, создающие пространства для жизни и работы.

Технология производства TSS плиты

TSS плита изготавливается технологичным способом. Относительно TSS, то аббревиатура в переводе на русский расшифровывается как термоструктурированная поверхность. Основой для производства являются МДФ и ДСП плиты, на которые наносятся пластичные элементы путём прессования.

ТСС плита производится на стыке технологий ЛДСП и HPL, объединяя в себе их обе.

  • На основу наносится путём пресования крафтовая бумага со специальной пропиткой
  • В качестве финишного слоя применяется дизайнерский меламин-фильм
  • В зависимости от требуемой текстуры, число слоёв варьируется от двух до пяти
  • Прессование всех слоёв осуществляется под высоким давлением
  • Осуществляется процесс, в результате которого все слои полимеризуются в специальной установке
  • Для создания ряда фактур совмещаются рисунки на тиснении и декоративном слое

Таким образом, достигается толщина финишного слоя становится равной 1,6 миллиметров. А толщина материала-основы составляет восемь и восемнадцать миллиметров. ТСС плита именно данных размеров наиболее востребована при производстве мебели и декора. К примеру, первые применяются в шкафах-купе, ящиках или декоративных стеновых панелях. Вторые актуальны для фасадов мебели, столешниц и прочих элементов.

Почему Cleaf панели так востребованы

Благодаря технологии производства, Cleaf панели могут имитировать различные материалы — дерево, камень, ткань, кожу. Это позволяет гармонично вписать в интерьер сделанную из них мебель, выдержав единый стиль. Плиты выпускаются в европейском формате размером 2800х2070 миллиметров. В Россию они приходят цельными, в готовом виде. А их резку, по желанию покупателя, выполняет непосредственно компания-дистрибьютор, если у неё имеются необходимые производственные мощности.

ТСС Клиф имеет целый ряд преимуществ не только по сравнению с ДСП, но и аналогичной продукцией других компаний. Итальянская фабрика уделяет огромное внимание не только безупречному внешнему виду и качеству своих изделий, но и их экологичности. При производстве используются формальдегиды класса безопасности Е1, что позволяет применять панель TSS Cleaf, в том числе и для производства детской мебели. Помимо этого материал отличается:

  • Высокими эксплуатационными качествами
  • Не деформируется и не теряет внешний вид при воздействии высоких температур
  • Специальная пропитка делает TSS панели долговечными, устойчивыми к царапинам
  • Не теряет свой внешний вид под прямыми солнечными лучами
  • Имеет высокую устойчивость к влаге
  • Позволяет чистку различными средствами, в том числе и химическими соединениями при необходимости

Компания разрабатывает и имеет патентное право производства уникальных декоров и структур. Фасады TSS Cleaf, за счёт особенностей производства, не только превосходно выглядят, но и обеспечивают непревзойдённые тактильные ощущения. Из них можно создать мебель в самых разных стилях, или использовать в качестве элементов декора от классики до хай-тека. Именно за эти свойства они и ценятся во всём мире

Где применяются ТСС панели

ТСС панели используются при производстве мебели или отделке помещений. Спектр применения ограничивается только дизайнерской мыслью. Разнообразие структур, цветовых решений и удобство в работе делают их одним из наиболее востребованных современных материалов. Спектр их применения достаточно широк:

  • Производство мебели — фасады TSS, столешницы, встроенные и отдельно стоящие шкафы, мебель для ванной
  • Металлические и межкомнатные двери
  • Стеновые панели
  • Торговое оборудование
  • Мебель и интерьер для кафе, ресторанов, отелей
  • Интерьерных решений

Если локацией обустройства является кухня, фасад TSS можно подобрать в соответствии общему интерьерному решению. Дизайнеры создают монохромные композиции, или гармонично сочетают плиты из коллекций по их цвету, фактуре и стилистике. Шкафчики, полочки, панно для стены позволяют организовать пространство, сделав его эксклюзивным.

Где купить плиту TSS

Если вам нужна плита TSS, купить её для своего производства или создания эксклюзивной мебели вы можете в «Распил Подольск». Мы является официальным поставщиком итальянского бренда. Вся линейка продукции представлена в нашем каталоге. А цены у нас ниже, чем у других компаний в Москве и области.

Помимо дистрибуции, мастера «Распил Подольск» быстро и качественно делают плиты и фасады любой конфигурации на современном оборудовании. Мы работаем с компаниями и частными лицами. Smart плита TSS, в умелых руках наших мебельщиков и дизайнеров, превращается в кухню, шкаф-купе, стеновую панель. Также мы производим мебель по дизайну заказчиков используя самые лучшие материалы и фурнитуру европейских производителей.

Эко-плиты TSS SMART

Компания SM’art является мировым лидером по производству TSS плит и HPL пластиков с очень высокими техническими и эстетическими характеристиками. Благодаря своим передовым технологиям и глубокому изучению всех используемых материалов компания SM’art является поставщиком номер один на мировом мебельном рынке.

Итальянская TSS плита (thermo struсturеd surface, термо-структурированная поверхность) — это уникальный материал, получаемый способом прессования декоративной бумаги, пропитанной меламиновой смолой, на древесные плиты. Инновационная технология производства позволяет достигать глубины тиснения до 300 мкм с толщиной поверхностного декоративного слоя до 1,6 мм, что и придает продукту уникальный 3D-эффект.

TSS плиты SM’art имеют неповторимые структуры, которые открывают новые возможности в интерьерном и мебельном дизайне, а также воплощают разнообразные варианты ваших идей и замыслов. Каждая коллекция SM’art уникальна. Создавая новую структуру, компания старается держаться подальше от того, что уже представлено на рынке. Она разрабатывает что-то новое, при этом всегда оставаясь рядом с реальностью. В линейку текстур входят декоры, имитирующие натуральные природные материалы, такие как дерево разных пород, камень, кожа, а также разнообразные ткани, бетон и т.д.

Основные преимущества TSS плит SM’art перед остальными производителями:

  • уникальное современное технологичное оборудование;
  • использование передовых технологий позволило SM’art совместить в своих коллекциях 3matt-эффект, что придает декорам невероятную реалистичность и натуральность;
  • разработка собственных ноу-хау;
  • постоянное отслеживание мировых тенденций в области дизайна интерьера и разработка уникальных коллекций, не имеющих мировых аналогов;
  • полный контроль над всей цепочкой от рождения декора до готового изделия;
  • предоставление потребителю классических, современных и авангардных решений в широкой гамме декоров;

TSS плита SM’art является экологически чистым материалом европейского стандарта качества, что подтверждено соответствующими сертификатами. Класс формальдегидов Е05 позволяет использовать плиты для изготовления мебели для детских комнат и спальных помещений. Высокий уровень стойкости к бытовым и производственным загрязнениям, таким как грязь, масла, жиры, косметические средства, а также ударопрочность делают SM’art плиты идеальным материалом для изготовления кухонь и отделки интерьеров гостиниц, кафе, ресторанов, фитнес-центров, магазинов и торговых центров.

Скачать документы


Фасады пластик CLEAF фасады

Мебельная индустрия стремительно развивается, с каждым годом появляются новые разработки на базе существующих. Сегодня набирают популярность мебельные фасады CLEAF итальянского производства. Это отделочный материал нового поколения, который формируется путем особого прессования. В процессе производства используются специальные пресс-формы, благодаря чему полученные плиты имеют глубоко проявленную структуру.

Клиф фасады повторяют:

  • тисненую ткань;
  • окаменелости;
  • пористую поверхность;
  • волны;
  • древесный спил;
  • каменную структуру;
  • любые другие природные и фантазийные поверхности.

Пластик Cleaf HPL

Применяется для производства кухонных фасадов и шкафов купе. Итальянский пластик отличается высокими эксплуатационными характеристиками:

  • устойчивость к механическим повреждениям и ударам;
  • влагостойкость;
  • экологичность – состоит из бумаги и смолы 3/7 не выделяет в токсичные вещества даже во время горения;
  • устойчивость к выгоранию под воздействием УФ лучей, сохраняет первоначальную насыщенность цвета спустя годы;
  • выдерживает без изменения характеристик температуру от -500С до +600С;
  • легкий вес;
  • долговечность.

Пластик HPL итальянского производства устойчив к температурным перепадам, трудногорючий (класс Г1).

Древесные декоры

Фантазийные фасады

Однотонные фасады

Фасады под камень

Плиты TSS Cleaf

Это совершенно новый продукт, аналогов которому нет среди европейских производителей. Сфера использования разнообразна:

  • производство кухонных фасадов;
  • изготовление корпусной мебели;
  • выпуск шкафов-купе, дверей, стеновых панелей и пр.

Итальянские плиты нашли широкое применение в сегменте HoReCa. Применяются при оформлении интерьеров в таких заведениях как рестораны, кафе, гостиницы. По эксплуатационным и эстетическим характеристикам плита TSS превосходит натуральный шпон.

Из преимуществ плит ТСС стоит выделить:

  • многослойное покрытие (до 5 слоев) обеспечивает неповторимую текстуру;
  • глубина тиснения до 250мкм;
  • толщина покрытия достигает 1,6 мм, обеспечивает устойчивость к истиранию и мелким повреждениям;
  • отталкивает загрязнения;
  • термостойкая;
  • не поддается воздействию химических веществ, агрессивных компонентов;
  • не выгорает под УФ лучами, сохраняя первоначальный вид долгие годы;
  • экологичность (класс эмиссии Е1 – абсолютно безвредна, предназначена для использования в жилых помещениях).

Основным достоинством итальянских плит является сочетание тактильного и визуального эффекта. Плиты имеют 2-сторонний рисунок, с обратной стороны плита идеально ровная. Наличие кромки ABS ко всем декорам обеспечивает целостный дизайн и продлевает срок эксплуатации мебели.

Фантазийные фасады

Древесные декоры

Фасады под камень

Мебельные фасады CLEAF итальянского производства. — Фабрика мебели «Мебиус»

Мебельная индустрия стремительно развивается, с каждым годом появляются новые разработки на базе существующих. Сегодня набирают популярность мебельные фасады CLEAF итальянского производства. Это отделочный материал нового поколения, который формируется путем особого прессования. В процессе производства используются специальные пресс-формы, благодаря чему полученные плиты имеют глубоко проявленную структуру.

Клиф фасады повторяют:

  • тисненую ткань;
  • окаменелости;
  • пористую поверхность;
  • волны;
  • древесный спил;
  • каменную структуру;
  • любые другие природные и фантазийные поверхности.

НОВИНКА!

Сверхматовый эффект с Piombo от CLEAF

Представляем совершенно новый продукт от CLEAF – материал со сверхматовым эффектом Piombo! Является частью коллекции Hyper Materials, разработанной для изготовления мебели и дизайна интерьеров. Поверхность с уникальной матовой фактурой создана путем отверждения акриловых смол электронно-лучевой обработкой. Преимуществом в эксплуатации являетося отсутствие отпечатков пальцев на поверхности. 

ХАРАКТЕРИСТИКИ

  • Панель 3050*1300*19 мм
  • Кромка ABS 1.0*23.0 мм

В чем особенность Piombo от CLEAF?

  1. Тактильное превосходство, к поверхности хочется прикоснуться.
  2. Стойкость к механическому воздействию – не остаются царапины и повреждения.
  3. Сверхматовый эффект, выраженная фактура.
  4. На поверхности не остаются отпечатки пальцев, что особенно актуально для кухонного пространства и мебели с механизмом открывания Tip-on.

Цветовые решения представлены в девяти вариантах. Преобладает классическая цветовая гамма – белое и черной, нежные бежевые, сдержанные серые оттенки, приближенные к природной палитре. 

 Пластик Cleaf HPL

  • Древесные декоры
  • Фантазийные фасады
  • Однотонные фасады
  • Фасады под камень

Применяется для производства кухонных фасадов и шкафов купе. Итальянский пластик отличается высокими эксплуатационными характеристиками:

  • устойчивость к механическим повреждениям и ударам;
  • влагостойкость;
  • экологичность – состоит из бумаги и смолы 3/7 не выделяет в токсичные вещества даже во время горения;
  • устойчивость к выгоранию под воздействием УФ лучей, сохраняет первоначальную насыщенность цвета спустя годы;
  • выдерживает без изменения характеристик температуру от -500С до +600С;
  • легкий вес;
  • долговечность.

Пластик HPL итальянского производства устойчив к температурным перепадам, трудногорючий (класс Г1).

Плиты TSS Cleaf

  • Фантазийные фасады
  • Древесные декоры
  • Фасады под камень

Это совершенно новый продукт, аналогов которому нет среди европейских производителей. Сфера использования разнообразна:

  • производство кухонных фасадов;
  • изготовление корпусной мебели;
  • выпуск шкафов-купе, дверей, стеновых панелей и пр.

Итальянские плиты нашли широкое применение в сегменте HoReCa. Применяются при оформлении интерьеров в таких заведениях как рестораны, кафе, гостиницы. По эксплуатационным и эстетическим характеристикам плита TSS превосходит натуральный шпон.

Из преимуществ плит ТСС стоит выделить:

  • многослойное покрытие (до 5 слоев) обеспечивает неповторимую текстуру;
  • глубина тиснения до 250мкм;
  • толщина покрытия достигает 1,6 мм, обеспечивает устойчивость к истиранию и мелким повреждениям;
  • отталкивает загрязнения;
  • термостойкая;
  • не поддается воздействию химических веществ, агрессивных компонентов;
  • не выгорает под УФ лучами, сохраняя первоначальный вид долгие годы;
  • экологичность (класс эмиссии Е1 – абсолютно безвредна, предназначена для использования в жилых помещениях).

Основным достоинством итальянских плит является сочетание тактильного и визуального эффекта. Плиты имеют 2-сторонний рисунок, с обратной стороны плита идеально ровная.  Наличие кромки ABS ко всем декорам обеспечивает целостный дизайн и продлевает срок эксплуатации мебели.

Gene | SHH

Анализ и техническая информация

Invitae — это аккредитованный Колледжем американских патологов (CAP) и внесены поправки в клинические лаборатории. (CLIA) -сертифицированная клинико-диагностическая лаборатория, выполняющая полное секвенирование генов и анализ делеций / дупликаций с использованием технологии секвенирования нового поколения (NGS).

Наш анализ последовательности охватывает клинически важные области каждого гена, включая кодирующие экзоны и от 10 до 20 оснований. пары соседних интронных последовательностей по обе стороны от кодирующих экзонов в транскрипте, перечисленном ниже, в зависимости от на конкретный ген или тест. Кроме того, анализ охватывает отдельные варианты без кодирования. Любые варианты, которые выпадают за пределами этих регионов не анализируются. Любые ограничения в анализе этих генов будут перечислены в отчете. Свяжитесь со службой поддержки клиентов с любыми вопросами.

На основании результатов валидационного исследования этот анализ достигает> 99% аналитической чувствительности и специфичности для одного нуклеотидные варианты, вставки и делеции длиной <15 п.н., а также делеции и дупликации на уровне экзонов. Методы Invitae также обнаруживают вставки и делеции размером более 15 п.н., но меньше, чем полный экзон, но чувствительность поскольку они могут быть незначительно уменьшены. Анализ делеции / дупликации Invitae определяет количество копий на одном экзоне разрешение практически на всех целевых экзонах.Однако в редких случаях события числа копий одного экзона могут не происходить. проанализированы из-за присущих свойств последовательностей или изолированного снижения качества данных. Определенные типы вариантов, такие как структурные перестройки (например, инверсии, события преобразования генов, транслокации и т. д.) или варианты встроены в последовательность со сложной архитектурой (например, короткие тандемные повторы или сегментные дупликации), не могут быть обнаружен. Кроме того, может быть невозможно полностью разрешить некоторые детали о вариантах, такие как мозаика, фазирование или неоднозначность отображения.Если явно не указано иное, изменения последовательности в промоторе, некодирующих экзонах, и другие некодирующие области не охватываются этим анализом. Пожалуйста, ознакомьтесь с определением теста на нашем сайте для подробные сведения о регионах или типах вариантов, которые включены или исключены для этого теста. Этот отчет отражает анализ выделенного образца геномной ДНК. В очень редких случаях (циркулирующее гематолимфоидное новообразование, костный мозг трансплантат, недавнее переливание крови) анализируемая ДНК может не отражать конституциональный геном пациента.

Ген Ссылка на стенограмму Анализ последовательности Анализ удаления / дублирования
SHH NM_000193.2

ограниченная экспрессия и дисморфология конечностей

J Anat. 2003 Jan; 202 (1): 13–20.

MRC Human Genetics Unit, Western General Hospital, Edinburgh, UK

Correspondence Dr Robert Hill, MRC Human Genetics Unit, Western General Hospital, Crewe Road, Edinburgh Eh5 2XU, UK. Тел. +44 (0) 131467 8410; факс: +44 (0) 131 343 2620; электронная почта: [email protected] Авторские права © Анатомическое общество Великобритании и Ирландии, 2003 г. Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Sonic hedgehog, SHH, необходим для моделирования конечности.Набор скелетных элементов, из которых состоят руки и ноги, и упорядоченное расположение этих костей для формирования рисунка пальцев рук и ног зависят от SHH. Механизм действия SHH на конечности до конца не изучен; однако аспект, который кажется важным, — это локализованная асимметричная экспрессия Shh . Shh экспрессируется в заднем крае зачатка конечности в области, определяемой как зона поляризующей активности (ZPA). Анализ мутантов мышей с полидактилией (дополнительными пальцами) показывает, что асимметричная экспрессия Shh теряется из-за появления эктопического домена экспрессии в переднем крае конечности.Один такой полидактильный мутант мыши, саскватч ( Ssq ), отображается в соответствующей хромосомной области преаксиальной полидактилии (PPD) человека и, таким образом, представляет собой модель этого состояния. Мутация, ответственная за Ssq , расположена на расстоянии 1 Mb от гена Shh ; однако мутация нарушает дальнодействующий cis -действующий регулятор экспрессии Shh . Таким образом, преаксиальная полидактилия человека является результатом аналогичного нарушения экспрессии Shh .Другие врожденные аномалии человека также отображаются рядом с локусом преаксиальной полидактилии, что указывает на главную хромосомную область дисморфологии конечностей. Различные фенотипы варьируются от потери всех костей рук и ног до синдактилии мягких тканей и слияния пальцев. Мы обсуждаем роль, которую играет экспрессия Shh в мутантных фенотипах мышей и дисморфологии конечностей человека.

Ключевые слова: acheiropodia, Lmbr1 , преаксиальная полидактилия, sasquatch, Shh

Введение

Во время развития профили градиентной концентрации сигнальных молекул предоставляют информацию по полю клеток.Концентрация молекулы сообщает клеткам, где они находятся и что им следует делать; такие молекулы известны как морфогены. В развитии конечностей фокальный регуляторный домен был постулирован Saunders & Gasseling (1968), что соответствует определению сигнального центра, ответственного за продукцию дифференцированного сигнала морфогена (Wolpert, 1969). Этот задний локализованный сигнальный центр является зоной поляризационной активности (ZPA) и отвечает за рисунок пальцев на наших руках и ногах или конечностях всех четвероногих.ZPA — это биологически отличная область клеток, которая имеет экспериментальный признак, заключающийся в том, что ею можно манипулировать и трансплантировать в разные участки конечности. Добавление ZPA к переднему краю конечности напротив нормального ZPA приводит к появлению дополнительных пальцев. В зачатке крыла цыпленка, в которой все (три) цифры уникальны и различимы, дополнительный ZPA дает дублирование цифр в зеркальном отображении нормального рисунка цифр; количество и идентичность цифр напрямую зависят от количества трансплантированных клеток ZPA (Tickle, 1981; см. также обзоры Panman & Zeller и Sanz-Ezquerro & Tickle в этом томе).

Поиск морфогена, ответственного за поляризующую активность, продуцируемую ZPA, остановился на молекуле, называемой sonic hedgehog (SHH) (Echelard et al. 1993; Krauss et al. 1993; Riddle et al. 1993; Roelink et al. 1994) ). SHH удовлетворял прогнозируемым критериям морфогена конечности. Во-первых, SHH, который является гомологом морфогена hedgehog (HH) Drosophila , является секретируемым фактором. Во-вторых, экспрессия сильно ограничена и совмещена с ZPA в зачатках конечностей позвоночных и, таким образом, продуцируется в локализованном источнике.Оба свойства важны для инициации дифференцированной продукции предполагаемого морфогена.

Доказательство того, что ген Shh участвует в поляризации конечности, получено в результате трансплантации продуцирующих SHH клеток или гранул, пропитанных белком SHH, в переднюю часть зачатка конечности. Оба метода лечения были способны производить дублирование пальцев в зеркальном отражении (Riddle et al. 1993; Chang et al. 1994; Lopez-Martinez et al. 1995). Кроме того, производство SHH «запускается» ретиноевой кислотой, известным индуктором ZPA (Riddle et al.1993). Удаление Shh у мышей с нокаутом также показывает, что SHH выполняет поляризующую функцию (Chiang et al. 1996). Мыши, гомозиготные по нокаутному аллелю Shh , обнаруживают серьезные дефекты во многих эмбриональных структурах, включая конечность. Мутанты имеют четыре конечности с узнаваемым паттерном A-P в стилоподе (плечевая / бедренная кость), но дистальнее стилопода формирование паттерна A-P сильно нарушено. Автопод передних конечностей представлен одним дистальным хрящевым элементом, тогда как автопод задних конечностей состоит из одного пальца (Chiang et al.2001; Kraus et al. 2001). Таким образом, SHH жизненно важен для активности ZPA и для формирования паттерна A-P zeugopod и autopod конечности.

Shh неправильная регуляция приводит к аномалиям конечностей мыши

Какие механизмы контролируют ограниченную экспрессию Shh в расположенной кзади ZPA зачатка конечности? Жесткий контроль транскрипции необходим для ограниченной продукции ZPA, необходимой для дифференцированного действия морфогена. В самом деле, реализация ограниченной экспрессии Shh привела к исследованиям роли неправильной регуляции как основы некоторых дисморфологий конечностей.Работа была сосредоточена на группе спонтанно полученных мутаций конечностей мыши, которые возникли с появлением дополнительных пальцев на преаксиальной (передней) стороне конечности: некоторые мутанты поражены одним набором конечностей, некоторые — обеими. Они были классифицированы как группа мутантов гемимел-люксат (). У многих из этих мутантов фенотип с дополнительными пальцами проявлялся как зеркальное отражение, отражая эксперименты по пересадке, проведенные в зачатке крыла цыпленка. Таким образом, неверно направленная экспрессия Shh кажется разумным механизмом для генерации полидактилии, и впоследствии было показано, что ряд этих преаксиальных полидактильных мышей экспрессируют Shh в переднем крае конечности.

Таблица 1

Гемимел-люксатные мутации, которые неправильно экспрессируются Shh

Генетические основы неправильной экспрессии Shh для трех из гемимел-люксатных мутаций известны, то есть гены, ответственные за Были идентифицированы люксоид Стронга ( lst ) и дополнительных пальца ( Xt ) (третий, sasquatch , обсуждается ниже). Существует три аллеля мутации lst , все из которых являются генетическими дефектами (один — целевая мутация в ES-клетках) в гене Alx4 (Qu et al.1997, 1998; Takahashi et al. 1998). Alx4 представляет собой гомеобокс-содержащий ген парного типа, который гомологичен Drosophila aristaless . Фенотип lst является результатом потери функции Alx4 и зависит от дозировки; у гетерозиготы задние конечности полидактильны, тогда как у гомозиготы поражаются все четыре конечности, а также проявляется более широкий фенотип. Предполагается, что Alx4 , возможно, через взаимодействия со связанным геном Cart1 (Qu et al.1999), важен для подавления экспрессии зачатка передней конечности гена Shh , важен для обеспечения асимметричной задней экспрессии гена. Gli3, — крупноподобный ген, содержащий цинковый палец, был идентифицирован как ген, ответственный за мутацию Xt (Hui & Joyner, 1993). Как постулируется для Alx4 , Gli3 может быть репрессором переднего Shh (Masuya et al. 1995; Buscher et al. 1997), так что уменьшение дозировки гена приводит к передней экспрессии Shh .(Другие роли Gli3 в конечности более подробно обсуждаются в этом томе: см. Обзор Panman & Zeller).

Ssq : регуляторный мутант Shh

Мы сосредоточили нашу работу на анализе полидактильной мутации Ssq . Мутация Ssq возникла в результате случайной вставки репортерной конструкции Hoxb1 человеческой плацентарной щелочной фосфатазы ( HPAP ) (Sharpe et al. 1999). У взрослых, гетерозиготных по мутации Ssq , передние конечности нормальны, но задние конечности демонстрируют преаксиальную полидактилию.Гомозиготы () демонстрируют более обширные аномалии конечностей, полидактилия задних конечностей более тяжелая, а у зевгопода наблюдается гемимелия (уменьшение длины большеберцовой кости). Гомозиготные передние конечности также демонстрируют преаксиальную полидактилию и небольшую гемимелию. Полудоминантный характер мутации Ssq и наблюдение, что задние конечности поражены более серьезно, чем передние, согласуются с другими членами группы мутантов hemimelia-luxate . Анализ экспрессии Shh в развивающихся конечностях Ssq показал, как и другие мутанты hemimelia-luxate , эктопическую переднюю экспрессию ().В отличие от большинства из группы hemimelia-luxate , никаких других дефектов за пределами конечности не наблюдается.

Сравнение конечностей при дисморфологии конечностей мыши и человека. На панелях A и C показаны кости левой передней (A) и задней (C) конечностей гомозиготной мыши Ssq . Панели B и D показывают рентгенограмму правой руки (B) и стопы (D) пациента с PPD. Римскими цифрами отмечены позиции нормальных цифр, а звездочками отмечены дополнительные цифры.

Сравнение паттернов экспрессии гена Shh и репортерного гена HPAP в конечностях мыши Ssq .Панели A и B показывают анализ гибридизации in situ и экспрессии Shh в зачатке задних конечностей эмбриона E10.5 (A) и эмбриона E12.5 (B). Конечности имеют двойную маркировку; Экспрессия Fgf8 в AER показана темно-коричневой меткой, а экспрессия Shh — синей. На всех панелях передний край конечности расположен вверху, а задний край — внизу. Выражение ZPA показано большой синей областью в нижней части панели, а меньший синий домен в верхней части панели представляет эктопическое выражение.Панели C и D показывают экспрессию щелочной фосфатазы из репортерного гена HPAP, который составляет трансген Ssq . Черные области показывают области активности щелочной фосфатазы в области, которая перекрывает ZPA на E10.5 (C) и E12.5 (D) и эктопический передний домен на E12.5.

Генетический анализ показал, что сайт инсерции трансгена на chr 5, который сегрегирует с полидактильным фенотипом, был физически связан с геном Shh , но находился на расстоянии почти 1 Мб () (Sharpe et al.1999). Сайт трансгенной вставки был клонирован, и было обнаружено, что он находится внутри интрона гена, идентифицированного как Lmbr1 (Lettice et al. 2002). Событие вставки привело к дублированию окружающего интрона ∼20 т.п.н.

Составное представление генов Lmbr1 / LMBR1 человека и мыши, показывающее относительные положения мутаций конечностей. Ген Lmbr1 состоит из 17 экзонов, представленных синими прямоугольниками, и находится на расстоянии 1 МБ от гена Shh (экзоны выделены красным).Представлено положение сайта встраивания Ssq в интроне 5 мыши и тесная связь с точкой разрыва транслокации PPD человека в соответствующем интроне человека. Скобки вокруг HPAP предполагают, что трансген включался несколько раз ( n > 10). Делеция ахейроподий показана вокруг экзона 4; большая часть делеции 5–6 т.п.н. — это интронная ДНК.

Мутации в конечностях человека, картированные в 7q36

Преаксиальная полидактилия (PPD [MIM1]), также известная как преаксиальная полидактилия типа II (MIM174500), является одним из наиболее часто наблюдаемых врожденных пороков развития конечностей человека.PPD наблюдается в единичных случаях, но у большинства пациентов наблюдается аутосомно-доминантный тип наследования. Фенотип, специфичный для конечностей, заметно варьируется в пределах семьи, начиная от простого добавления фаланги в трехфаланговом большом пальце до дупликации целого пальца и аплазии большеберцовой кости. Генетический анализ семей показал, что локус PPD, картированный в области 450 т.п.н. на хромосоме 7q36 (Heus et al., 1999), и все затронутые семьи, описанные до сих пор, связаны с этим локусом (Heutink et al. 1994; Zguricas et al.1994; Hing et al. 1995; Радхакришна и др. 1997). PPD находится в хромосомной области, синтеничной области Lmbr1 хромосомы 5 мыши, и специфична для конечностей. Сходство фенотипа (сравните A, C с B, D) и геномной локализации между Ssq и конечност-специфичным PPD привело нас к предположению, что Ssq является мышиной моделью PPD. Интересно, однако, что тщательный анализ структурного гена LMBR1 не смог выявить каких-либо вредных мутаций (Lettice et al. 2002).

Значительный прогресс в исследовании генетической основы PPD произошел от молодого японского пациента PPD, у которого было обнаружено, что он несет реципрокную транслокацию de novo t (5,7) (q11, q36) (Lettice et al. 2002). Точное картирование идентифицировало местоположение точки разрыва транслокации (), которая находится внутри интрона 5 LMBR1 , соответствующего интрона мыши, несущего вставку Ssq .

Основа полидактильных мутаций

Изначально считалось, что нарушения гена Lmbr1 у мыши и человека играют роль в генерации фенотипа полидактилии, возможно, действуя как регулятор гена Shh . Lmbr1 кодирует белок из 490 аминокислот (LMBR1) (Clark et al. 2000) и, возможно, пептид из 32 аминокислот путем альтернативного сплайсинга (LMBR1S). LMBR1 гидрофобен и предположительно содержит девять трансмембранных доменов. Однако, несмотря на усилия нескольких групп, включая нашу, значительная экспрессия Lmbr1 не могла быть обнаружена в паттерне, имеющем отношение к развитию, в зачатке конечности мыши путем гибридизации in situ и (неопубликованные наблюдения), что позволяет предположить, что экспрессируется Lmbr1 на низких уровнях, вероятно, повсеместно у мышей.Во-вторых, что более важно, не было обнаружено соответствующих мутаций в структурном гене Lmbr1 у человека или мыши.

Как обсуждалось выше, мутация Ssq была генерирована случайной вставкой трансгена, который включал репортер HPAP . Интересно, что в отличие от других семи линий, созданных с той же конструкцией, когда Ssq эмбрионов были проанализированы на активность HPAP , они продемонстрировали экспрессию HPAP в конечности в дополнение к типичному паттерну ромбомера-4, опосредованному элементами Hoxb1 внутри трансгена (Sharpe et al.1999). Паттерн конечностей впервые обнаруживается в ZPA на E10.5 () и очень похож на эндогенный Shh на конечности. Гетерозиготные животные Ssq также проявляют активность HPAP в перекрывающемся переднем домене зачатков задних конечностей, который отражает переднюю эктопическую Shh (). Гомозиготные эмбрионы демонстрируют переднее окрашивание HPAP на передних конечностях, что согласуется с появлением эктопического Shh . Таким образом, репортер HPAP в сайте вставки Ssq отражает как нормальную, так и эктопическую экспрессию Shh в зачатках конечностей Ssq гетерозигот и гомозигот.

Эти наблюдения предложили вторую гипотезу, что трансген HPAP во вставке Ssq попал под влияние регулятора гена, действующего на cis , который управляет экспрессией в зачатке конечности. Возможный сценарий состоит в том, что событие вставки Ssq выявило присутствие этого регулятора, необходимого для управления экспрессией Shh в конечности, и, кроме того, нарушило активность, так что Shh становится переднеэкспрессированным в конечности Ssq . бутоны.Эта гипотеза привлекательна, поскольку не требует, чтобы мутации конечностей, упомянутые выше, влияли на экспрессию Lmbr1 . Вместо этого различные генетические поражения, картированные на chr 7q36 человека / chr 5 мыши, могут действовать, чтобы нарушить cis -действующих регуляторных элементов Shh .

Генетический тест для различения гипотез

Для изучения основы преаксиальной полидактилии был разработан генетический тест цис-транс . Проверенный прогноз заключался в том, что регулятор Shh будет работать в режиме действия cis-, т.е.е. мутация Ssq повлияет только на хромосомно сцепленный Shh . Напротив, нарушение структурного гена Lmbr1 , которое вторично влияет на экспрессию Shh , будет действовать на обоих аллелях Shh и, следовательно, на транс . Было разработано скрещивание мышей для получения рекомбинантной хромосомы 5, в которой мутация Ssq была локализована в cis с целевым нулевым аллелем Shh . При анализе фенотипа мыши, несущие рекомбинантную хромосому, будут демонстрировать дополнительные преаксиальные пальцы ног, если Ssq действует на Shh в транс и лапы дикого типа, т.е.е. подавление фенотипа Ssq , если действует в цис .

Анализ фенотипа конечностей у пяти рекомбинантных мышей не показал преаксиальной полидактилии или других обнаруживаемых фенотипов конечностей. Таким образом, данные демонстрируют, что нулевой аллель Shh инактивирует влияние мутации Ssq , когда он расположен в cis (но не в trans ) на хромосоме 5. Отсюда следует, что вставка Ssq является доминирующим действием. мутация, которая препятствует специфической для конечностей экспрессии Shh .Эти данные согласуются с специфическим для конечностей регулятором дальнего действия Shh , находящимся внутри или рядом с геном Lmbr1 . Кроме того, данные согласуются с PPD человека, возникающим в результате аналогичного нарушения дальнодействующего регулятора SHH .

Ахейроподии: врожденные аномалии без рук или ног

Область хромосомы 7q36 человека становится основным локусом дефектов конечностей. Помимо PPD, существуют другие дефекты, включая ахейроподии (Янакиев и др.2001), сложная полисиндактилия (CPS) (Tsukurov et al. 1994) и акропекторальный синдром (отдельный, но связанный с F-синдромом) (Dundar et al. 2001) — карта области 7q36. У мыши две дополнительные мутации отображаются на соответствующей хромосоме мыши. Спонтанно возникшая мутация hemimelic extra toe ( Hx ) (Clark et al.2000), вероятный аллель Ssq , отображается на тот же локус, но отличается от hammertoe ( Hm , фенотип синдактилии). ), который может быть мышиным аналогом человеческого CPS.

CPS у человека встречается реже, чем PPD, и обычно двусторонний, проявляя как пре-, так и постаксиальную полидактилию и синдактилию (слияние мягких тканей между пальцами) (Tsukurov et al. 1994). Акропекторальный синдром аналогичен, демонстрируя преаксиальную полидактилию и синдактилию мягких тканей: однако у пациентов наблюдаются другие дефекты скелета, такие как выступающая верхняя часть грудины и U-образный синус с слепым концом в передней стенке грудной клетки. Несмотря на убедительность сопоставления, мало что известно о молекулярной этиологии CPS или акропекторального синдрома.Недавнее сообщение, однако, показало, что аутосомно-рецессивные ахейроподии (Ianakiev et al. 2001) являются результатом небольшой делеции в гене LMBR1 . Ахейроподия — это тяжелый фенотип, специфичный для конечностей, и, в отличие от PPD, у пациентов наблюдается потеря всех костей рук и ног, а большеберцовая кость усечена дистально. Анализ пяти семей с ахейроподиями (Янакиев и др., 2001) выявил критическую область для мутации в 7q36, и впоследствии затронутые люди показали делеции в обоих аллелях LMBR1 , которые удаляют экзон 4 и приблизительно 5-6 т.п.н. окружающей геномной ДНК (). .Эти данные были интерпретированы как предполагающие, что ахейроподии возникают в результате потери функции гена Lmbr1 .

Модель роли Shh в дефектах конечностей

Мы прогнозируем, что встроенный трансген в геном Ssq , экспрессия которого активируется в паттерне конечностей, подобном Shh , отмечает ближайший регулятор, который управляет нормальным Shh. выражение. Таким образом, регуляторы, ответственные как за нормальную, так и за аномальную экспрессию Shh , могут находиться в гене Lmbr1 или рядом с ним.Опубликованный до сих пор анализ не различает регуляцию, зависящую от хроматина или структуры хромосомы, или от традиционного энхансерного элемента. Ясно, что для продвижения регулирования междугородной связи Shh () требуется ряд различных регулирующих действий. Во-первых, регулятор д. Передавать сигнал раннего зачатка конечности на расстояние 1 Mb, чтобы инициировать и управлять экспрессией Shh . Во-вторых, поскольку Lmbr1 находится в кластере тесно связанных генов, ни один из которых не экспрессируется в конечности, регулятор должен быть способен контролировать экспрессию Shh , не влияя на экспрессию ближайших генов.В-третьих, элементы, которые управляют экспрессией Shh в переднем крае зачатка конечности, существуют, но обычно д. Репрессироваться.

Shh Регуляторная модель возникновения аномалий конечностей у мышей и людей. Постулируется наличие множества элементов для главного регулятора Shh , специфичного для конечностей. Эти элементы лежат в гене Lmbr1 или рядом с ним. По крайней мере, два элемента необходимы для генерации различных фенотипов конечностей, представленных Ssq (и PPD) и ахейроподиями.Во-первых, постулируется энхансер (серый прямоугольник), который управляет как нормальной экспрессией ZPA, так и эктопической передней экспрессией (эктопическая экспрессия, показанная на рисунке). Во-вторых, присутствует репрессор (заштрихованная рамка), который подавляет эктопическую переднюю экспрессию. Вставка трансгена Ssq (синий прямоугольник) нарушает репрессор, позволяя переднюю экспрессию, и в этом процессе трансген попал под влияние энхансера (дает паттерн, показанный на рисунке). Делеция ахейроподий удаляет и инактивирует энхансер, так что отсутствует специфическая для конечностей экспрессия Shh .

Дальнейшие прогнозы предполагают, что дальнодействующий регулятор Shh является дефектным в дисморфологии конечностей, которая отображается на хромосоме 7q36 человека. Нарушение различных компонентов регулятора приводит к описанному спектру дисморфических фенотипов. Мы предполагаем, что преаксиальная полидактилия является результатом нарушения предполагаемого репрессора экспрессии зачатка передней конечности. Местоположение сайта инсерции трансгена Ssq и точка разрыва хромосомной транслокации PPD предполагает, что приблизительное геномное местоположение этого репрессора находится в интроне 5 гена Lmbr1 или рядом с ним.Этот репрессор обычно действует, чтобы подавить переднюю экспрессию; генетические мутации, однако, нарушают этот репрессор и делают возможной неправильную экспрессию Shh . Поскольку PPD относительно распространен в человеческой популяции (Heutink et al. 1994), кажется вероятным, что ряд независимых мутаций прерывают репрессорный элемент.

Кроме того, мы предполагаем, что LMBR1 также является случайным для фенотипа acheiropodia, и предлагаем альтернативное обоснование (). Делеция ахейроподий размером ~ 5 т.п.н. из гена LMBR1 удаляет экзон 4 и окружающие интронные последовательности.В соответствии с предложением генерировать полидактилию, мы предполагаем, что мутация acheiropodia разрушает регуляторный элемент SHH ; однако этот механизм отличается от PPD тем, что нормальная экспрессия ZPA SHH нарушена. Эти регуляторные элементы, ответственные за фенотип, могут находиться в удаленной области, окружающей экзон 4. Сравнение фенотипа acheiropodia с целевой делецией мыши Shh (Chiang et al. 1996) наводит на мысль, что потеря Shh играет ключевую роль.У мутантных мышей Shh — / — конечности обнаруживают потерю всех костей стоп и усечений длинных костей, аналогично тому, что наблюдается у пациентов с ахейроподиями (Chiang et al. 2001; Kraus et al. 2001). Мы предполагаем, что в отличие от Ssq и PPD, ахейроподии возникают в результате специфической для конечности потери экспрессии Shh . Таким образом, в зависимости от типа мутации могут возникать различные фенотипы. В настоящее время нет гипотезы о том, как возникают CPS и акропекторальные синдромы.Молекулярный анализ предложенных регуляторов Shh потребуется для более четкого понимания нормальной регуляции и связи с этими дисморфологиями конечностей.

Выводы

Теперь открыта дверь для молекулярного анализа специфической для конечностей регуляции Shh , чтобы помочь ответить на некоторые нерешенные вопросы, связанные с генетикой этих аномалий конечностей. Прежде всего, это проблема, связанная с природой регуляторных элементов, нарушенных мутациями мыши и человека.Эти элементы расположены на расстоянии ~ 1 мб от целевого гена. Таким образом, являются ли эти элементы основой для формирования хроматина или хромосомной структуры, относящейся к транскрипционной активности Shh ? Альтернативно, могут ли энхансерные элементы действовать на таком расстоянии хромосомы, чтобы регулировать ген? Трудно понять, почему регуляторные элементы располагаются на таком расстоянии от гена, который они регулируют, и в усложняющих обстоятельствах, когда они находятся ближе к незатронутым генам. Такое расположение предполагаемых регуляторов вдоль хромосомы может помочь в точном определении как активаторов транскрипции, так и сайленсеров, а большое расстояние может помочь в раскрытии предполагаемых взаимодействий хроматина.

Вторая загадка, предложенная анализом, обсужденным выше, — это передняя эктопическая экспрессия Shh . Предположительно, молекулярным следствием нормальной экспрессии может быть эктопическая передняя экспрессия в зачатке конечности. Следовательно, для достижения нормального асимметричного паттерна передняя экспрессия должна быть подавлена. Интересно, что ранние четвероногие, такие как Acanthostega и Ichthyostega , имели большие ступни, состоящие из 7-8 пальцев (Kardong, 1998), возможно, продукт примитивного, не репрессированного паттерна экспрессии Shh .Молекулы-кандидаты, участвующие в передней репрессии Shh , предложены другими мутантами мыши из группы hemimelia-luxate , и в настоящее время лучшим кандидатом является Alx4 . Дальнейшие исследования, возможно, прольют больше света как на нормальную регуляцию Shh , так и на механизмы генерации фенотипов болезни.

Ссылки

  • Buscher D, Bosse B, Heymer J, Ruther U. Доказательства генетического контроля Sonic hedgehog с помощью Gli3 в развитии конечностей мыши.Мех. Dev. 1997. 62: 175–182. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чанг Д.Т., Лопес А., фон Кесслер Д.П., Чианг К., Симандл Б.К., Чжао Р. и др. Продукты, генетическая связь и активность формирования паттерна конечностей гена hedgehog у мышей. Разработка. 1994; 120: 3339–3353. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чианг К., Литингтунг Й., Ли Э., Янг К.Э., Корден Д.Л., Вестфаль Х. и др. Циклопия и дефект осевого паттерна у мышей, лишенных функции гена Sonic hedgehog. Природа. 1996. 383: 407–413. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чианг К., Литингтунг Й., Харрис М.П., ​​Симандл Б.К., Ли Й., Бичи П.А. и др.Проявление препаттерна конечности: развитие конечности при отсутствии функции звукового ежа. Dev. Биол. 2001; 236: 421–435. [PubMed] [Google Scholar]
  • Кларк Р.М., Marker PC, Kingsley DM. Новый ген-кандидат для преаксиальной полидактилии мыши и человека с измененной экспрессией в конечностях мутантных мышей Hemimelic extra-toes. Геномика. 2000. 67: 19–27. [PubMed] [Google Scholar]
  • Дундар М., Гордон Т.М., Озязган И., Огузкая Ф., Озкул Ю., Кук А. и др. Новый акропекторальный синдром отображается на хромосоме 7q36.J. Med. Genet. 2001; 38: 304–309. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Echelard Y, Epstein DJ, St-Jacques B, Shen L, Mohler J, McMahon JA, et al. Sonic hedgehog, член семейства предполагаемых сигнальных молекул, участвует в регуляции полярности ЦНС. Клетка. 1993; 75: 1417–1430. [PubMed] [Google Scholar]
  • Heus HC, Hing A, van Baren MJ, Joosse M, Breedveld GJ, Wang JC и др. Физическая и транскрипционная карта преаксиального локуса полидактилии на хромосоме 7q36.Геномика. 1999; 57: 342–351. [PubMed] [Google Scholar]
  • Heutink P, Zguricas J, van Oosterhout L, Breedveld GJ, Testers L, Sandkuijl LA, et al. Ген трехфалангового большого пальца отображается в субтеломерной области хромосомы 7q. Nat. Genet. 1994; 6: 287–292. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hing AV, Helms C, Slaugh R, Burgess A, Wang JC, Herman T. и др. Сцепление преаксиальной полидактилии типа 2–7q36. Являюсь. J. Med. Genet. 1995. 58: 128–135. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хуэй С.К., Джойнер А.Л.Мышиная модель синдрома тяжелой цефалополисиндактилии: мутация extra-toesJ содержит внутригенную делецию гена Gli3. Nat. Genet. 1993; 3: 241–246. [PubMed] [Google Scholar]
  • Янакиев П., ван Барен М.Дж., Дейли М.Дж., Толедо С.П., Кавальканти М.Г., Нето Дж.С. и др. Причиной ахейроподии является геномная делеция в C7orf2, человеческом ортологе гена Lmbr1. Являюсь. J. Hum. Genet. 2001; 68: 38–45. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Кардонг К. Позвоночные: сравнительная анатомия, функция, эволюция.Бостон Массачусетс: Макгроу-Хилл .; 1998. [Google Scholar]
  • Kraus P, Fraidenraich D, Loomis CA. Некоторые структуры дистальных конечностей развиваются у мышей, лишенных передачи сигналов Sonic hedgehog. Мех. Dev. 2001; 100: 45–58. [PubMed] [Google Scholar]
  • Krauss S, Concordet JP, Ingham PW. Функционально консервативный гомолог гена полярности сегмента дрозофилы hh экспрессируется в тканях с поляризующей активностью у эмбрионов рыбок данио. Клетка. 1993; 75: 1431–1444. [PubMed] [Google Scholar]
  • Lettice L, Hecksher-Sorensen J, Hill RE.Доминантная мутация гемимелии разъединяет эпителиально-мезенхимальные взаимодействия и нарушает образование передней мезенхимы в задних конечностях мышей. Разработка. 1999; 126: 4729–4736. [PubMed] [Google Scholar]
  • Леттис Л.А., Хорикоши Т., Хини С.Дж., ван Барен М.Дж., ван дер Линде ХК, Бридвелд Г.Дж. и др. Нарушение цис-действующего регулятора дальнего действия для Shh вызывает преаксиальную полидактилию. Proc. Natl Acad. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 2002; 99: 7548–7553. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Lopez-Martinez A, Chang DT, Chiang C, Porter JA, Ros MA, Simandl BK, et al.Активность формирования паттерна конечностей и ограниченная задняя локализация аминоконцевого продукта расщепления Sonic hedgehog. CurrBiol. 1995; 5: 791–796. [PubMed] [Google Scholar]
  • Масуя Х., Сагай Т., Вакана С., Мориваки К., Широиши Т. Дублированная зона поляризующей активности у мутантов полидактильных мышей. Genes Dev. 1995; 9: 1645–1653. [PubMed] [Google Scholar]
  • Масуя Х., Сагай Т., Мориваки К., Широиси Т. Мультигенный контроль локализации зоны поляризующей активности в морфогенезе конечностей у мышей.DevBiol. 1997. 182: 42–51. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ку С., Нисвендер К.Д., Джи К., ван дер Меер Р., Кини Д., Магнусон М.А. и др. Полидактилия и эктопическое образование ZPA у мутантных мышей Alx-4. Разработка. 1997; 124: 3999–4008. [PubMed] [Google Scholar]
  • Qu S, Tucker SC, Ehrlich JS, Levorse JM, Flaherty LA, Wisdom R, et al. Мутации у мышей Aristaless-like4 вызывают люксозную полидактилию Стронга. Разработка. 1998. 125: 2711–2721. [PubMed] [Google Scholar]
  • Цюй С., Такер С.К., Чжао К., деКромбрюгге Б., Уисдом Р.Физические и генетические взаимодействия между Alx4 и Cart1. Разработка. 1999. 126: 359–369. [PubMed] [Google Scholar]
  • Радхакришна У., Блуин Дж. Л., Мехенни Х., Патель У. К., Патель М. Н., Соланки Дж. В. и др. Картирование одной формы аутосомно-доминантной постаксиальной полидактилии типа A на хромосоме 7p15-q11.23 с помощью анализа сцепления. Являюсь. J. Hum. Genet. 1997; 60: 597–604. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Riddle RD, Johnson RL, Laufer E, Tabin C. Ежик Соник опосредует поляризующую активность ZPA.Клетка. 1993; 75: 1401–1416. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ролинк Х., Аугсбургер А., Хемскерк Дж., Корж В., Норлин С., Руис и Алтаба А. и др. Индукция дна пластинки и мотонейрона с помощью vhh-1, гомолога hedgehog у позвоночных, экспрессируемого хордой. Клетка. 1994; 76: 761–775. [PubMed] [Google Scholar]
  • Saunders JW, Gasseling MT. Эктодерма-мезенхимальные взаимодействия в истоках симметрии крыльев. В: Флейшман Р., Биллингем Р. Э., редакторы. Эпителиально-мезенхимальные взаимодействия. Балтимор: Уильямс и Уилкинс; 1968 г.С. 78–97. [Google Scholar]
  • Шарп Дж., Леттис Л., Хекшер-Соренсен Дж., Фокс М., Хилл Р., Крумлауф Р. Идентификация звукового ежа в качестве гена-кандидата, ответственного за мутантную полидактильную мышь Sasquatch. Curr. Биол. 1999; 9: 97–100. [PubMed] [Google Scholar]
  • Такахаши М., Тамура К., Бушер Д., Масуя Х., Йоней-Тамура С., Мацумото К. и др. Роль Alx-4 в установлении переднезадней полярности во время развития конечностей позвоночных. Разработка. 1998; 125: 4417–4425.[PubMed] [Google Scholar]
  • Tickle C. Число ячеек поляризационной области, необходимое для определения дополнительных цифр в развивающемся крыле цыпленка. Природа. 1981; 289: 295–298. [PubMed] [Google Scholar]
  • Цукуров О., Бёмер А., Флинн Дж., Николай Дж. П., Хамель BC, Трэйл С. и др. Сложный двусторонний локус болезни полисиндактилии отображается на хромосоме 7q36. Nat. Genet. 1994. 6: 282–286. [PubMed] [Google Scholar]
  • Вольперт Л. Позиционная информация и пространственный паттерн клеточной дифференциации.J. Theor. Биол. 1969; 25: 1–47. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zguricas J, Snijders PJ, Hovius SE, Heutink P, Oostra BA, Lindhout D. Фенотипический анализ трехфалангового большого пальца и связанных с ним пороков развития кисти. J. Med. Genet. 1994; 31: 462–467. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Myf5 является прямой мишенью для передачи сигналов Shh на большие расстояния и регуляции Gli для спецификации мышц

Genes Dev. 2002, 1 января; 16 (1): 114–126.

, 1, 3, 4 , 1, 3, 4 , 1, 3 , 1, 3 , 1, 3 3 , 1, 3 2, 3 и 1, 3, 5

Маркус К.Густафссон

1 Департамент клеточной биологии и биологии развития, 2 Департамент генетики и 3 Penn Center for Development Biology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania 19104, USA

Hua Pan

1 Департамент клеточной биологии и биологии развития, 2 Департамент генетики и 3 Центр биологии развития Пенсильванского университета, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Дебора Ф.Пинни

1 Департамент клеточной биологии и биологии развития, 2 Департамент генетики и 3 Пеннский центр биологии развития, Медицинская школа Университета Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Юнлян Лю

1 Департамент клеточной биологии и биологии развития, 2 Департамент генетики и 3 Центр биологии развития Пенсильванского университета, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Анна Левандовски

1 Департамент Клеточная биология и биология развития, 2 Департамент генетики и 3 Пеннский центр биологии развития, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Дуглас Дж.Эпштейн

1 Департамент клеточной биологии и биологии развития, 2 Департамент генетики и 3 Пеннский центр биологии развития, Медицинская школа Университета Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

Чарльз П. Эмерсон, Jr.

1 Департамент клеточной биологии и биологии развития, 2 Департамент генетики и 3 Penn Centre for Development Biology, Медицинский факультет Университета Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

1 Департамент of Cell and Developmental Biology, 2 Департамент генетики и 3 Penn Centre for Developmental Biology, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США

4 Эти авторы внесли равный вклад в эту работу.

5 Автор, ответственный за переписку.

Поступило 24 августа 2001 г .; Принято 1 ноября 2001 г.

Copyright © 2002, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Sonic hedgehog (Shh) — секретируемая сигнальная молекула для формирования паттерна тканей и спецификации стволовых клеток у эмбрионов позвоночных. Shh опосредует как дальнодействующие, так и краткосрочные сигнальные ответы в эмбриональных тканях посредством активации и репрессии генов-мишеней своими эффекторами фактора транскрипции Gli.Несмотря на хорошо изученные функции передачи сигналов Shh в развитии и заболеваниях человека, гены-мишени для развития регуляции Gli практически неизвестны. В этом исследовании мы исследуем роль передачи сигналов Shh в контроле Myf5 , гена, регулирующего скелетные мышцы, для спецификации мышечных стволовых клеток у эмбрионов позвоночных. В предыдущих генетических исследованиях мы показали, что Shh необходим для экспрессии Myf5 в спецификации дорсальных сомитов, предшественников эпаксиальных мышц.Однако эти исследования не различают, является ли Myf5 прямой мишенью для регуляции Gli посредством передачи сигналов Shh на большие расстояния, или, альтернативно, регуляция Myf5 является вторичным ответом на передачу сигналов Shh. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали трансгенный анализ с репортерными генами lacZ , чтобы охарактеризовать энхансер транскрипции Myf5 , который контролирует активацию экспрессии Myf5 в предшественниках эпаксиальных мышц сомитов у эмбрионов мыши.Этот энхансер эпаксиального сомита (ES) Myf5 является Shh-зависимым, о чем свидетельствует его полная неактивность в сомитах гомозиготных мутантных эмбрионов Shh и его пониженная активность в гетерозиготных мутантных эмбрионах Shh . Более того, Shh и расположенные ниже по ходу трансдукторы сигналов Shh специфически индуцируют репортеры энхансера ES / люциферазы в Shh-чувствительных клетках 3T3. Сайт связывания Gli, расположенный внутри энхансера ES, необходим для активации энхансера передачей сигналов Shh в трансфицированных клетках 3T3 и в предшественниках эпаксиальных сомитов у трансгенных эмбрионов.Эти находки устанавливают, что Myf5 является прямой мишенью для передачи сигналов Shh на большие расстояния посредством позитивной регуляции с помощью факторов транскрипции Gli, обеспечивая доказательства того, что передача сигналов Shh имеет прямую индуктивную функцию в спецификации клеточного клона.

Ключевые слова: Sonic hedgehog, Gli, Myf5, сомиты, спецификация мышц

Sonic hedgehog (Shh) является членом семейства сигнальных молекул Hedgehog (HH). У позвоночных Shh функционирует как морфоген, опосредуя передачу сигналов дальнего и ближнего действия для формирования дорсально-вентрального паттерна в спецификации клонов нервных, мезодермальных и энтодермальных стволовых клеток (Chiang et al.1996; Эриксон и др. 1996; Goodrich et al. 1997; Hebrok et al. 2000; Рамальо-Сантос и др. 2000), для формирования паттерна конечностей (Riddle et al. 1993), для пролиферации гранулярных клеток (Wechsler-Reya and Scott 1999) и для подавления апоптоза тканей (Teillet et al. 1998). Мутации, которые нарушают передачу сигналов Shh, вызывают врожденные дефекты человека (Muenke and Cohen 2000) и предрасположенность к раку у мышей и людей (Goodrich and Scott 1998; Hahn et al. 1999). Передача сигналов Hedgehog у Drosophila контролирует формирование кутикулярного паттерна у эмбрионов и тканевого паттерна во время более позднего развития (Dahmann and Basler 2000).Сигналы HH передаются отвечающим эмбриональным клеткам посредством связывания HH с рецептором Patched (Ingham et al. 1991; Marigo et al. 1996a; Stone et al. 1996; Fuse et al. 1999), который является негативным регулятором передачи сигналов HH в отсутствие лиганда. Связывание HH с Patched блокирует его репрессию другого трансмембранного белка, Smoothened (Smo), который индуцирует передачу сигнала путем активации ядерной транслокации Ci / Gli, факторов транскрипции цинковых пальцев (van den Heuvel and Ingham 1996). У позвоночных передача сигнала HH опосредуется тремя эффекторами фактора транскрипции Gli (Hui et al.1994). Drosophila Ci выполняет двойную функцию. Как необработанная форма Ci опосредует положительные транскрипционные ответы на сигнальную активность Hedgehog, тогда как его процессированные формы функционируют как репрессоры транскрипции (Porter et al. 1995; Aza-Blanc et al. 1997; Chen et al. 1999). В конечности позвоночных Gli3 дифференцированно обрабатывается с образованием репрессора транскрипции в условиях низкой передачи сигналов Shh, обеспечивая механизм, контролирующий дифференциальную активность Gli3 в ответ на передачу сигналов Shh на большие и короткие расстояния (Wang et al.2000). Передача сигналов HH на большие расстояния у эмбрионов требует его автопроцессинга и модификации N-терминального холестерина (Lewis et al. 2001; Zeng et al. 2001), а также гепаран-сульфатных протеогликанов для обеспечения его внеклеточной передачи (Bellaiche et al. 1998). Последовательная передача сигналов Shh обеспечивает позитивную и негативную регуляцию формирования паттерна нервной трубки судьбы нервных клеток (Roelink et al. 1995; Ericson et al. 1997; Briscoe and Ericson 1999), хотя роль белков Gli в этих процессах остается неясной.

Хотя важность передачи сигналов Shh в развитии и заболеваниях человека хорошо установлена, транскрипционные мишени передачи сигналов Shh через факторы транскрипции Gli практически неизвестны. Считается, что в ответ на процессы передачи сигнала, инициированные передачей сигналов HH, факторы транскрипции Gli / Ci подвергаются ядерной транслокации (Robbins et al. 1997; Sisson et al. 1997; Kogerman et al. 1999), что приводит к их связыванию с мотивами последовательности-мишени. в регуляторных элементах генов-мишеней (Kinzler, Vogelstein, 1990; Von Ohlen et al.1997). Gli1 и Gli2 функционируют как положительные регуляторы факторов транскрипции, тогда как обработанный Gli3 функционирует как отрицательный регулятор (Sasaki et al. 1999; Wang et al. 2000). У Drosophila и позвоночных компоненты самого пути передачи сигнала HH подвергаются прямой регуляции положительной и отрицательной обратной связи. Patched Экспрессия положительно регулируется передачей сигналов HH посредством регуляции Gli / Ci, обеспечивая механизм отрицательной обратной связи для передачи сигнала Shh (Alexandre et al.1996; Goodrich et al. 1996; Мариго и др. 1996b). У позвоночных Gli1 также положительно и напрямую регулируется передачей сигналов HH через важные сайты связывания Gli (Lee et al. 1997; Dai et al. 1999), обеспечивая механизм позитивной регуляции передачи сигналов HH. Только несколько онтогенетических регуляторных генов были идентифицированы как прямые мишени регуляции Gli / Ci. У Drosophila передача сигналов HH регулирует Wingless в формировании паттерна кутикулы (Heemskerk and DiNardo 1994) через сайты связывания C (Von Ohlen et al.1997). У эмбрионов позвоночных HNF3-β является регулятором раннего развития хорды и формирования пластинки дна (Ang and Rossant, 1994; Weinstein et al. 1994; Dufort et al. 1998), и его экспрессия в пластине дна контролируется Shh. и регуляция Gli2 (Ding et al. 1998; Matise et al. 1998) посредством энхансера дна пластинки, который имеет важный сайт связывания Gli (Sasaki et al. 1997).

Передача сигналов Shh влияет на множество процессов развития, включая пролиферацию (Wechsler-Reya and Scott, 1999) и апоптоз (Teillet et al.1998; Borycki et al. 1999), что привело к спорам относительно того, обладает ли Shh индуктивными или трофическими сигнальными функциями. В частности, было неизвестно, регулирует ли передача сигналов Shh посредством его эффекторов фактора транскрипции Gli гены-мишени, которые контролируют спецификацию клеточных клонов, или, альтернативно, регулирует ли они гены-мишени, которые обеспечивают выживание и пролиферацию специфических клонов эмбриональных клеток. Чтобы понять функции Shh в спецификации клонов мышечных клеток, мы исследовали роль передачи сигналов Shh в контроле Myf5 , гена фактора транскрипции bHLH, который контролирует спецификацию клонов миогенных стволовых клеток в эмбрионе позвоночных (Rudnicki et al.1993; Таджбахш и др. 1996b). Myf5 активируется в разных анатомических участках эмбриона под контролем отдельных цис -действующих регуляторных элементов (Hadchouel et al. 2000; Summerbell et al. 2000; Carvajal et al. 2001), отвечая на различные сигналы развития ( Munsterberg et al. 1995; Borycki et al. 1998; Tajbakhsh et al. 1998). Эксперименты по генетической индукции и индукции эксплантата установили, что Shh, продуцируемый хордой, является важным сигналом для активации Myf5 в эпаксиальных мышечных предшественниках дорсального сомита, но не в мышечных предшественниках в других участках активации Myf5 и миогенной спецификации в эмбрион (Borycki et al.1999). У мутантных эмбрионов Shh Myf5 не может активироваться специфически в эпаксиальной области сомита при отсутствии локализованных дефектов пролиферации клеток и апоптоза. Однако эти исследования не решили, является ли Myf5 прямой мишенью передачи сигналов Shh посредством регуляции Gli, или, альтернативно, регуляция Myf5 является вторичным ответом на передачу сигналов Shh.

Чтобы исследовать функцию факторов транскрипции Gli в регуляции Myf5 , мы идентифицировали энхансер эпаксиального сомита (ES) Myf5 и охарактеризовали его ответ на передачу сигналов Shh с использованием комбинации подходов трансгенной и клеточной трансфекции.Этот энхансер ES также был идентифицирован среди набора регуляторных элементов в крупномасштабных исследованиях трансгенной экспрессии в домене 650 kb локуса мыши MRF4 / Myf5 (Zweigerdt et al. 1997; Hadchouel et al. 2000; Summerbell и др., 2000; Карвахал и др., 2001). Эти энхансеры контролируют активацию и поддержание экспрессии Myf5 и MRF4 в конечностях, жаберных дугах и предшественниках эпаксиальных и гипаксиальных мышц. Энхансер ES является уникальным в локусе MRF4 / Myf5 из-за его транскрипционной активности в эпаксиальных мышечных предшественниках дорсального сомита.В этом исследовании мы подробно исследовали онтогенетическую активность энхансера ES в сомитах развивающихся эмбрионов дикого типа и гомозиготных и гетерозиготных мутантных эмбрионов Shh (Chiang et al. 1996), а также в Shh-чувствительных клетках 3T3. (Taipale et al. 2000), модель культуры предшественников сомитной мезодермы (Taylor and Jones 1979). Эти исследования показывают, что передача сигналов Shh контролирует активацию энхансера Myf5 ES как в эпаксиальных мышечных клетках-предшественниках во время образования сомитов, так и в клетках 3T3, отвечающих на индукцию Shh.Более того, Shh-регуляция энхансера ES в сомитах и ​​в клетках 3T3 опосредуется через важный сайт связывания фактора транскрипции Gli. Эти находки устанавливают, что Myf5 является прямой мишенью для передачи сигналов Shh на большие расстояния, чтобы контролировать спецификацию клеток-предшественников сомитов эпаксиального миогенного клона. Кроме того, в отличие от конечностей и нервной трубки, где передача сигналов Shh на большие расстояния опосредует негативную регуляцию (Briscoe and Ericson 1999; Wang et al. 2000), мы показали, что Myf5 в дорсальном сомите отвечает на передачу сигналов Shh посредством положительной регуляции. с помощью факторов транскрипции Gli, установив, что дальнодействующая передача сигналов Shh выполняет прямую транскрипционную функцию в регуляции Myf5 для спецификации эпаксиальных мышечных предшественников.

Результаты

Энхансер транскрипции Myf5, специфичный для эпаксиальных мышечных предшественников сомитов

Клон ВАС локуса MRF4 / Myf5 был выделен из библиотеки геномной ДНК мыши, и субклоны были охарактеризованы анализом последовательности и функциональными анализами энхансера с использованием временных трансгенез с использованием репортера гена lacZ , экспрессируемого под контролем гетерологичного вирусного промотора tk (Goldhamer et al. 1992). Эти исследования идентифицировали энхансер длиной 651 п.н., расположенный в 6.6 kb 5 ‘сайта начала транскрипции Myf5 (Tajbakhsh et al. 1996a) во внутригенной области MRF4 / Myf5 (рис.). Этот энхансер Myf5 из 651 п.н. активирует экспрессию репортера в мышцах-предшественниках эпаксиального сомита, а также в клетках мозга у эмбрионов через 9,5 дней после полового акта (dpc) (рис.) И имеет обширную (86%) идентичность с эквивалентной областью 3 ‘ крыса MRF4 (Pin et al. 1997), включая консервативную последовательность, родственную последовательностям сайта связывания Gli (Kinzler and Vogelstein 1990).

Организация энхансера Myf5 ES в локусе MRF4 / Myf5 и трансгене lacZ . Энхансерный элемент Myf5 ES длиной 651 п.н. расположен на 6,6 т.п.н. выше сайта транскрипции Myf5 , рядом с 3′-концом гена MRF4 . Транскрипционную активность энхансера ES оценивали с использованием трансгена lacZ с вирусным промотором tk, как показано. Кандидат Gli-связывающий сайт (Gli wt enh) расположен на 470 п.н. в энхансере.Центральная область сайта связывания Gli в энхансере ES Myf5 (красный прямоугольник) является вариантом в положении 477 от консенсусного сайта связывания Gli, определенного выбором сайта (Kinzler and Vogelstein 1990), и в позициях 472 и 477 из Сайт Gli в энхансере дна пластины HNF-3β (Sasaki et al. 1997). Мутации с заменой нуклеотидов, введенные в эту последовательность Gli (Gli mut enh), нарушают ее Gli-связывающую и функциональную активность.

Энхансер Myf5 ES / lacZ трансген активируется в головном мозге и в эпаксиальных сомитах в координации с образованием сомитов.( A ) Экспрессию трансгена энхансера ES / lacZ анализировали гистоэнзиматическим окрашиванием β-gal целых препаратов 8,25–11,5-dpc-эмбрионов, выделенных от самок зародышевой линии E1, гетерозиготных по энхансеру ES / lacZ трансген. Специфическое окрашивание было обнаружено в головном мозге (красная стрелка) на всех стадиях и во всех сомитах вдоль передней и задней оси эмбриона на ранних стадиях (панели a c ) и преимущественно в восьми задних сомитах новорожденных на более поздних стадиях. сцены (панели д, е ).Эктопическое окрашивание дорсальной нервной трубки часто встречается у трансгенных эмбрионов зародышевой линии E1 (белая стрелка), но не у транзиторных трансгенных эмбрионов (см. Рис. A). При 8,25 dpc ( a ) окрашивание наблюдается в затылочных сомитах, которые являются первыми сомитами, образованными в эмбрионе, а при 8,75 dpc ( b ) и 9,5 dpc ( c ) окрашивание наблюдается в сомитах. вдоль всей оси, включая новейшие задние сомиты (красные скобки). К 10,5 dpc окрашивание преобладает в восьми новейших задних сомитах (красная скобка), и только рассеянное окрашивание наблюдается в более зрелых передних сомитах.Эмбрион размером 9,5 dpc ( c ) был разрезан поперек вдоль передней к задней оси эмбриона в самом заднем, новообразованном эпителиальном сомите (панель c1 ), непосредственно переднем сомите, который сформировал дермотом и дорсальную медиальную губу. ( c2 ) и передний сомит, инициировавший образование миотома ( c3 ). (s) склеротом; (дм) дермомиотом; (мой) миотом; (dml) дорсальная медиальная губа; (нт) нервная трубка; (NC) нотохорд. ( B ) Экспрессию трансгена EShancer / lacZ анализировали на эмбрионах на 9.0 dpc путем гибридизации in situ целиком (ISH) с использованием антисмысловых DIG-зондов Myf5 (панель a ) и lacZ антисмысловых DIG-зондов (панель b ), а также путем гистоферментного окрашивания β-галлов целиком ( панель c ). Стрелки и скобки разграничивают границы экспрессии трансгена lacZ и транскрипта Myf5 в эпаксиальном сомите, как это было определено этими различными методами. Транскрипты lacZ , экспрессируемые трансгеном ES-энхансера / lacZ , локализуются только в самом дорсальном аспекте эпаксиального сомита ( b ), тогда как активность фермента β-gal в более передних сомитах имеет более широкое распределение от дорсального до вентрального. , простираясь от дорсального эпаксиального домена к более вентральному положению, где формируется миотом.

Гистоэнзиматический анализ экспрессии β-галактозидазы (β-gal) показал, что трансген Myf5 ES энхансер / lacZ активируется в сомитах эмбрионов уже в 8,25 dpc, когда сомиты впервые образуются и хромосомный Myf5 активируется сначала активируется в предшественниках эпаксиальных мышц. Myf5 Активация координируется с образованием сомитов, и экспрессия сохраняется во вновь образованных сомитах до 11,5 dpc, когда формирование сомитов завершено (Fig. A).Экспрессия также может быть обнаружена в головном мозге на этих стадиях развития (Daubas et al. 2000), а также в передней нервной трубке в двух исследованных трансгенных линиях зародышевой линии, E1 и E2. Экспрессия нервной трубки не наблюдалась у транзиторных трансгенных эмбрионов (см. Рис. А ниже). Экспрессия в головном мозге локализована в области медиального продольного пучка и маммиллотегментарных трактов, где экспрессируется Myf5 (Daubas et al. 2000), хотя окрашенные β-gal клетки занимают более широкий домен, чем сообщается в анализах гибридизации in situ. Myf5 расшифровки.У эмбрионов от 8,25 до 9,5 dpc окрашивание β-gal обильно в сомитах вдоль всей передне-задней оси, включая новейшие сформированные сомиты в заднем эмбрионе (Рис. A, панели a – c). Эта активность репортерного гена повторяет экспрессию хромосомного Myf5 и предшествует экспрессии всех других регуляторных факторов мышц, включая MRF4 (Ott et al. 1991; Tajbakhsh et al. 1997). На более поздних стадиях развития активность β-gal преимущественно локализуется в восьми новейших образовавшихся сомитах, где сначала активируется Myf5 (Tajbakhsh et al.1996a), а активность значительно снижается в более зрелых передних сомитах, в которых только несколько окрашенных клеток обнаруживаются в миотоме и дермотоме (Fig. A, панели d, e). Эти паттерны экспрессии сомитов устанавливают, что энхансер ES контролирует активацию транскрипции Myf5 во вновь образованных сомитах, но не поддерживает его экспрессию во время созревания сомитов.

Активация энхансера ES Myf5 ES в сомитах и ​​головном мозге опосредуется его Gli-связывающей последовательностью.Конструкции энхансера Myf5 ES / lacZ , содержащие сайт связывания Gli дикого типа (Gli wt enh) или мутантный (Gli mut enh), вводили в эмбрионы для транзиторного трансгенеза с помощью парануклеарной инъекции. Эмбрионы выделяли при 8,5 и 9,5 dpc, генотипировали для идентификации трансгенных эмбрионов и анализировали на экспрессию репортера путем окрашивания β-gal. ( A, левая панель ) Эмбрион 9,5 dpc, экспрессирующий трансген Gli wt enh дикого типа с репортерной активностью в сомитах и ​​головном мозге (красная стрелка).( Правая панель ) 9,5-dpc Gli mut enh трансгенный эмбрион с эктопической экспрессией трансгена в вентральном сомите (белая стрелка), но не в дорсальном эпаксиальном сомите. Этот эмбрион был единственным из 24 трансгенных эмбрионов Gli mut enh, у которых наблюдалось эктопическое окрашивание сомитов. ( B ) Табличная сводка экспрессии трансгена Gli wt enh и Gli mut enh в сомитах трансгенных эмбрионов с 8,5 и 9,5 dpc.Экспрессия эпаксиального сомита мутантного энхансера Gli полностью блокируется. Только один 9,5-dpc-эмбрион Gli mut enh (*), показанный в A , имел эктопическую экспрессию в сомите.

Чтобы исследовать дорсально-вентральный паттерн активности энхансера ES в сомитах, эмбрионы, окрашенные β-gal, были разделены вдоль их передней и задней осей с шагом 9,5 dpc, когда сомиты окрашены вдоль всей оси (рис. A, панели c1– c3). Усиливающая активность обнаруживается в первом, новейшем сомите в заднем эмбрионе, и эта экспрессия локализована в кластере дорсальных медиальных сомитных клеток, которые, как известно, активируют хромосомный Myf5 для спецификации эпаксиальных мышечных клеток-предшественников (Tajbakhsh et al.1997). Усиливающая активность не была обнаружена в пресомитной мезодерме на любой стадии развития у транзиторных трансгенных эмбрионов или трансгенных эмбрионов зародышевой линии. В более задних сомитах экспрессия трансгена локализована только на дорсальной медиальной губе (DML) дермомиотома, который является пролиферативным источником клеток-предшественников, которые формируют первые эпаксиальные мышцы миотома эмбриона. Окрашивание β-галактозидазой сохраняется в этих предшественниках DML в более зрелых передних сомитах, которые инициировали образование миотома, но большое количество окрашенных клеток также заселяет дорсальный аспект миотома и дорсальный аспект вышележащего дермотома, которые образованы дорсальной и вентральная миграция клеток DML к этим сайтам (Ordahl et al.2001). Ранее окрашивание β-gal трансгенных линий dermotome ES энхансера / lacZ интерпретировалось как эктопическая активность энхансера, который, как полагали, лишен негативного регуляторного элемента (Summerbell et al. 2000). Альтернативно, окрашивание дермотома и миотома β-gal может отражать персистентность фермента β-gal в отсутствие устойчивой транскрипционной активности трансгена ES / lacZ . Чтобы различить эти возможности, мы сравнили экспрессию трансгена энхансера ES / lacZ с использованием окрашивания ферментом β-gal с анализами гибридизации in situ целиком для обнаружения транскриптов β-gal (рис.Б, панели а – в). Эти эксперименты показывают, что lacZ РНК-транскриптов ограничены DML во всех сомитах, включая передние сомиты. Транскрипты не были обнаружены в дермотоме или миотоме, где активность фермента β-gal накапливается и сохраняется во время созревания сомита. Сходная локализация транскриптов β-gal наблюдалась в исследованиях экспрессии трансгенов lacZ , контролируемой более крупной последовательностью 23 т.п.н. перед промотором Myf5 , который включал энхансер ES (Hadchouel et al.2000). Эти данные устанавливают, что энхансер Myf5 ES транскрипционно активен только в эпаксиальных мышечных клетках-предшественниках DML, и его транскрипционная активность не поддерживается, поскольку клетки DML мигрируют дорсально и вентрально с образованием как миотома, так и дермотома, таким образом опровергая возможность что отрицательный регуляторный элемент необходим для локальной экспрессии энхансера ES в мышечных предшественниках эпаксиальных сомитов.

Энхансер Myf5 ES имеет функциональный сайт связывания фактора транскрипции Gli

Энхансер Myf5 ES имеет элемент последовательности, связанный с Gli-связывающими последовательностями (рис.; Кинзлер и Фогельштейн 1990; Сасаки и др. 1997), предполагая, что этот энхансер является прямой мишенью индукции Shh посредством регуляции фактора транскрипции Gli. Поскольку сайты связывания Gli в энхансерах транскрипции ранее не были хорошо задокументированы, мы выполнили анализы связывания сдвига электрофоретической подвижности, чтобы проверить, связывает ли этот элемент последовательности Myf5 Gli белки. Меченый Myc белок Gli2, экспрессируемый в системе экспрессии ретикулоцитов, реагировал с радиоактивно меченными олигонуклеотидами последовательности Gli энхансера Myf5 ES, и комплексы белок-ДНК анализировали с помощью анализов сдвига электрофоретической подвижности.Мы обнаружили, что белок Gli2, продуцируемый в экстрактах ретикулоцитов, образует стабильные комплексы ДНК-белок с целевой последовательностью энхансера Myf5 , и эти комплексы могут быть суперсмещены с помощью анти-myc антител, показывая, что эти комплексы образуются путем связывания меченного myc Gli2 белка к последовательности энхансера Myf5 (рис. A). Связывание белка Gli2 с сайтом энхансера ES является последовательностным и основано на конкуренции с избытком олигонуклеотида Gli дикого типа (Gli wt ), но не с избытком олигонуклеотидов Gli mut с мутациями замещения оснований, которые разрушают ядро ​​ДНК Gli. -последовательность привязки (см. рис.). Ядерные меченные Myc белки Gli1 и Gli2, экспрессируемые в клетках 293 и миобластах C2C12, также специфически связываются с олигонуклеотидами Gli wt в этих анализах сдвига геля (данные не показаны), обеспечивая подтверждающие доказательства того, что факторы транскрипции Gli могут специфически связываться с сайтом Gli в усилитель Myf5 .

Идентификация функционального сайта связывания Gli в энхансере Myf5 ES. ( A ) Анализы сдвига подвижности с помощью электрофореза показывают, что меченный Myc белок Gli2, экспрессируемый в лизатах ретикулоцитов (лизат TNT), связывается и образует комплекс сдвига геля с радиоактивно меченным 32 P олигонуклеотидом из 32 п.н. энхансера ES дикого типа. введите сайт Gli (mGli2-myc).100-кратный избыток олигонуклеотида Gli сайта дикого типа (Gli wt ) конкурирует за связывание Gli2-myc с радиоактивно меченным олигонуклеотидом дикого типа, тогда как мутантный олигонуклеотид Gli сайта (Gli mut ) не конкурирует за связывание. Анти-Myc антитела (myc Ab) суперсдвигающие комплексы Gli2 – myc гелевого сдвига, тогда как контрольные антитела (мышиный IgG) не имеют эффекта, показывая, что Gli2 является основным компонентом этих гелевых сдвигающих комплексов. ( B ) Люциферазные репортеры 8 × мультимеризованных сайтов связывания Gli дикого типа (8 × Gli wt ) и 8 × мутантных сайтов связывания Gli (8 × Gli mut ) из энхансера ES Myf5 котрансфицировали в Клетки 3T3 с векторами экспрессии mGli1 или mGli2 мыши.Результаты выражены в виде кратности индукции, которая представляет собой отношение активности люциферазы, индуцированной в клетках, трансфицированных Gli, к базовой активности люциферазы в контрольных трансфицированных клетках 3Т3. И Gli1, и Gli2 являются сильными активаторами транскрипции репортера 8 × Gli wt , но не репортером 8 × Gli mut , что показывает, что сайт связывания Gli энхансера ES может образовывать активные транскрипционные комплексы с факторами транскрипции Gli, синтезируемыми in vivo. .

Чтобы проверить, образует ли связывание Gli с сайтом связывания Gli энхансера ES активный транскрипционный комплекс, Shh-чувствительные клетки 3T3 (Taipale et al.2000) были котрансфицированы генами-репортерами люциферазы из 8-ми мультимеризованных генов дикого типа (8x Gli wt ) и мутантных (8x Gli mut ) Gli-связывающих сайтов, с векторами экспрессии Gli1 или Gli2 и со ссылкой Renilla. плазмида (рис. Б). Репортер 8 × Gli wt трансактивирован в 500 раз с помощью Gli1 и в 30 раз с помощью экспрессионных векторов Gli2, тогда как 8 × Gli mut не трансактивируется ни Gli1, ни Gli2. Эти биохимические и функциональные исследования, следовательно, устанавливают, что энхансер Myf5 ES имеет функциональный сайт связывания Gli для регуляции Shh.

Shh контролирует активацию энхансера Myf5 ES и эпаксиальную экспрессию эндогенного Myf5 et al. 1996), которые затем были скрещены для получения пометов 9,0–9,5-dpc гетерозиготных (+/–) и гомозиготных (- / -) мутантных эмбрионов

Shh , несущих репортерную конструкцию, для полного анализа экспрессии трансгена ( Инжир.А). Все проанализированные эмбрионы Shh — / — ( n = 3) показывают полное отсутствие окрашивания β-gal во всех сомитах, включая вновь образованные задние сомиты, где энхансер сначала активируется у эмбрионов дикого типа (рис. .A, панель c). Экспрессия трансгена в головном мозге также была устранена у всех Shh — / — эмбрионов, но эктопическая экспрессия трансгена нервной трубки сохранялась на высоком уровне, обеспечивая удобный внутренний контроль активности трансгена в мутантных эмбрионах.Важно отметить, что мы обнаружили, что активность энхансера Myf5 ES значительно снижена в сомитах всех проанализированных мутантных эмбрионов Shh +/- ( n = 4). Экспрессия была наиболее сильно потеряна в задних, новейших сформированных сомитах, которые имели небольшую экспрессию трансгена или не имели ее (фиг. B, ср. Панели c и d). Экспрессия нервной трубки и мозга остается высокой у Shh +/- эмбрионов по сравнению со сниженной экспрессией сомитов (Fig. B, ср. Панели a и b). У гетерозиготных мутантных эмбрионов окрашивание β-gal, хотя и снижено, продолжает ограничиваться DML, что согласуется с нормальным дорсальным паттерном активности трансгена энхансера ES.Дорсальный дермотом и морфология миотома нормальны у гетерозиготных мутантных эмбрионов Shh (Borycki et al.1999), что дает дополнительные доказательства того, что активация энхансера ES контролируется передачей сигналов Shh и что дефектная активация Myf5 у мутантных эмбрионов Shh не происходит. результат первичных дефектов созревания сомита.

Активация трансгена энхансера / люциферазы Myf5 ES в сомитах и ​​головном мозге нарушается у гомозиготных и гетерозиготных мутантных эмбрионов Shh .( A ) (панель a ) Эмбрионы дикого типа ( Shh + / + ) и эмбрионы, которые были (панель b ) гетерозиготными мутантами Shh ( Shh +/- ) и (панель c ) гомозиготный мутант Shh ( Shh — / — ) окрашивали на β-gal для анализа активности трансгена lacZ в головном мозге (красная стрелка), сомитах (красная скобка) и нервная трубка (белая стрелка). Все эмбрионы гетерозиготны по трансгену энхансера ES / lacZ .Активность энхансера ES полностью отсутствует в сомитах и ​​головном мозге гомозиготных мутантных эмбрионов и значительно снижена у гетерозиготных мутантных эмбрионов даже в условиях длительного окрашивания, тогда как эктопическая экспрессия нервной трубки сохраняется. ( B ) (панели a, c ) Гетерозиготные Shh мутантные (+/-) и (панели b, d ) эмбрионы дикого типа (+ / +) были проанализированы на окрашивание β-gal, а затем срезы для локализации окрашивания в сомитах и ​​нервной трубке в передней ( a, b ) и задней ( c, d ) областях эмбриона.У эмбрионов Shh +/- активность трансгена lacZ снижена в передних сомитах ( a ) и почти полностью отсутствует в самых задних сомитах ( c ). (dml) Дермомиотом; (s) сомит; (nt) нервная трубка. ( C ) (панель a ) Дикий тип Shh + / + и (панель b ) гомозиготный мутант Shh — / — эмбрионы с 8,75 dpc были проанализированы на экспрессию Myf5 гибридизацией in situ.У эмбрионов дикого типа ( a ) Myf5 активируется исключительно в эпаксиальном домене вновь образованных сомитов, тогда как у Shh — / — эмбрионов ( b ) экспрессия Myf5 нарушается в эпаксиальный домен новообразованных сомитов. Myf5 Экспрессия распределяется диффузно на низких уровнях, особенно в четырех наиболее передних затылочных сомитах (красная скобка). Эта низкоуровневая экспрессия не локализуется в эпаксиальном домене в дорсальном сомите, но распределяется по медиальным и латеральным аспектам сомита.Окрашивание головы Shh — / — эмбрионов не воспроизводится.

Чтобы выяснить, требуется ли передача сигналов Shh для эпаксиальной экспрессии эндогенного гена Myf5 во время образования первого сомита, были проведены полные тесты гибридизации in situ в 8.75-dpc Shh + / + и Shh — / — эмбрионов. У эмбрионов дикого типа на этой стадии развития экспрессия Myf5 ограничена эпаксиальным доменом вновь образованных сомитов (рис.В, панель а). У Shh — / — эмбрионов экспрессия Myf5 распределена диффузно, на низких уровнях, наиболее заметно в четырех наиболее передних затылочных сомитах (Fig. C, panel b). Эта низкоуровневая экспрессия не локализована в эпаксиальном домене в дорсальном сомите, но распределена по медиальным и латеральным аспектам сомита, что согласуется с нашими ранее сообщенными наблюдениями экспрессии Myf5 во вновь образованных сомитах Shh . — / — эмбриона в 9.75 dpc (Borycki et al., 1999). Сниженные уровни экспрессии Myf5 также описаны в большинстве передних затылочных сомитов Smoothened мутантных эмбрионов , которые также нарушены в передаче сигналов Shh (Zhang et al. 2001).

Чтобы дополнительно проверить, является ли энхансер ES целью передачи сигналов Shh, мы исследовали ответ передачи сигналов Shh энхансера ES в Shh-чувствительных клетках 3T3 (Taipale et al. 2000). Для этих экспериментов энхансер ES Myf5 , клонированный в репортерный ген люциферазы с δ-кристаллическим промотором, котрансфицировали в клетки 3T3 вместе с репортером Renilla и векторами экспрессии, кодирующими компоненты передачи сигналов Shh.Индукторы Shh включают Shh, онкогенную мутантную форму Smoothened (SmoM2), которая конститутивно активирует передачу сигнала Shh (Taipale et al. 2000), а также Gli1 и Gli2. Каждый из этих компонентов передачи сигналов Shh, как было обнаружено, активирует энхансер Myf5 ES (Fig. A), устанавливая, что Shh выполняет индуктивную функцию в регуляции энхансера Myf5 ES. Роль передачи сигналов Shh в активации энхансера Myf5 и ES дополнительно подтверждается результатами исследований ингибиторов Shh. Индукция Shh энхансера Myf5 ES полностью ингибировалась форсколином, антагонистом передачи сигналов Shh (рис.б; Fan et al. 1995), а также циклопамином, соединением, которое нарушает способность Smo опосредовать передачу сигналов Shh (Fig. C; Taipale et al. 2000), дополнительно подтверждая гипотезу, что передача сигналов Shh специфически индуцирует активацию энхансера ES.

Передача сигналов Shh активирует эпаксиальный энхансер Myf5 через его сайт связывания Gli в клетках 3T3. Myf5 ES-энхансер / репортерная плазмида люциферазы с сайтами Gli дикого типа (Gli wt ) и мутантными (Gli mut ) котрансфицировали в культуры клеток 3T3 с экспрессией Gli1, Gli2, Shh и активированным Smoothened (SmoM2). векторные плазмиды.Люциферазная активность трансгена энхансера ES / люциферазы в ответ на индукцию различными компонентами передачи сигналов Shh выражается как кратная индукция, которая представляет люциферазную активность дикого типа или мутантного энхансера ES / репортера люциферазы в ответ на индукторы относительно его активности. в трансфицированных контрольных клетках без индукторов. ( a ) В необработанных контрольных культурах энхансер ES дикого типа был индуцирован Shh, активированным SmoM2, Gli1 и Gli2; и эта индукция Shh блокировалась мутацией сайта связывания Gli в энхансере ES.( b ) В культурах, обработанных 10 мкМ форсколином, антагонистом передачи сигналов Shh (Fan et al. 1995), энхансер ES дикого типа полностью блокировался в своем ответе на Shh и активировал SmoM2, значительно снижая его ответ на Gli1 и Gli2, а мутантный Gli-энхансер ES полностью не реагировал на индукцию сигнальными компонентами. ( c ) В культурах, обработанных 1 мкМ циклопамина, энхансер ES дикого типа полностью блокируется в своем ответе на Shh и снижается, но не блокируется в его активации SmoM2, Gli1 и Gli2, что согласуется с активностью циклопамина как ингибитор функции Smo (Taipale et al.2000).

Shh-индукция энхансера Myf5 ES опосредуется его сайтом связывания Gli

Чтобы определить, регулирует ли Shh активацию энхансера Myf5 ES посредством факторов транскрипции Gli, мы сначала использовали анализы трансфекции 3T3 для сравнения индукции Shh Myf5. Репортеры люциферазы энхансера ES с сайтом связывания Gli дикого типа (Gli wt enh) или мутантным (Gli mut enh). Эти исследования показывают, что мутации Gli-связывающего сайта, которые блокируют связывание ДНК, блокируют трансактивацию энхансера Myf5 ES с помощью Shh, SmoM2, Gli1 и Gli2 (рис.а – в). Кроме того, форсколин и циклопамин не снижают далее активность мутантного энхансера Gli ниже базальной активности в отсутствие передачи сигналов Shh, что свидетельствует о том, что эти ингибиторы напрямую блокируют индукцию Shh и не подавляют другие активности, необходимые для ответа репортерного гена (рис. B). , в).

Затем мы использовали временные трансгенные анализы, чтобы определить, требуется ли сайт Gli в энхансере Myf5 ES для репортерной экспрессии в эпаксиальном сомите. Myf5 ES-энхансер / lacZ конструкции, содержащие либо Gli-связывающие сайты дикого типа (Gli wt enh), либо мутантные (Gli mut enh), Gli-связывающие сайты вводили в эмбрионы с помощью пронуклеарной инъекции, и экспрессию β-gal в сомитах и мозг исследовали на эмбрионах с 8,5 и 9,5 dpc (рис.), а также на 10,5 dpc (данные не показаны). Эти исследования показали, что мутация Gli-связывающего сайта в энхансере ES полностью блокирует активацию репортера в эпаксиальном сомите у всех исследованных трансгенных эмбрионов.Следовательно, сайт связывания Gli в трансгене ES-энхансера выполняет важную положительную регуляторную функцию для активации энхансера во вновь образованных сомитах на множественных стадиях развития. Примечательно, что мутация сайта Gli в энхансере ES не вызывает неправильную экспрессию энхансера на других участках ткани передачи сигналов Shh в эмбрионе, таких как нервная трубка, что свидетельствует о том, что этот сайт Gli не функционирует для подавления активности энхансера ES в других клетках. родословные. Вместе эти исследования трансгенной трансфекции и трансфекции 3T3 устанавливают, что активация энхансера Myf5 и ES в эпаксиальном сомите опосредуется посредством передачи сигналов Shh дальнего действия под положительным контролем факторов транскрипции Gli.

Обсуждение

Это исследование сообщает об идентификации Shh-регулируемого энхансера, который контролирует активацию Myf5 , главного регуляторного гена для спецификации эпаксиальных клеток-предшественников скелетных мышц (Rudnicki et al. 1993; Tajbakhsh et al. 1996b). Энхансер Myf5 ES активирует экспрессию репортера в эпаксиальных мышцах-предшественниках вновь формирующихся сомитов от 8,25 dpc, когда сомиты впервые образуются в развивающемся эмбрионе, до 11,5 dpc, когда формирование сомитов завершено.Активность энхансера ES для регуляции эпаксиального сомита уникальна в области 650 т.п.н. вокруг локуса MRF4 / Myf5 , который, как было показано, включает другие энхансеры, которые направляют экспрессию трансгена Myf5 на все другие домены мышечного предшественника. спецификации у эмбриона, включая жаберные дуги, зачаток конечностей и гипаксиальный сомит (Patapoutian et al. 1993; Zweigerdt et al. 1997; Hadchouel et al. 2000; Summerbell et al. 2000). Поскольку Myf5 является важным регулятором спецификации эпаксиальных мышц, наше открытие, что энхансер ES Myf5 является прямой мишенью передачи сигналов Shh через важный сайт связывания Gli, является первым доказательством того, что Shh выполняет прямую индуктивную функцию в этом процессе. спецификации клеточного происхождения.Помимо экспрессии эпаксиального сомита, энхансер ES также контролирует экспрессию Myf5 и в продольных треках развивающегося мозга (Daubas et al. 2000). Активность энхансера ES в головном мозге также опосредуется его сайтом связывания Gli, и хотя домен репортерной активности энхансера ES / lacZ шире, чем экспрессия транскриптов Myf5 , эти клетки мозга находятся рядом с источником Shh , указывая на то, что транскрипционная активность энхансера ES в головном мозге также контролируется передачей сигналов Shh.

Наши результаты показывают, что энхансер Myf5 ES находится под положительной регуляцией с помощью передачи сигналов Shh и регуляции Gli через сайт Gli, который мы идентифицировали в анализах связывания ДНК / белка и функциональной транскрипции. Этот сайт связывания Gli необходим для активности энхансера в сомитах и ​​головном мозге как при 8,5, так и 9,5 dpc, а также для индукции Shh в клетках 3T3. Примечательно, что мутация сайта Gli не приводила к эктопической активности энхансера в сомите или других эмбриональных тканях, указывая тем самым, что энхансер подвергается положительной регуляции с помощью факторов транскрипции Gli.Поскольку этот сайт Gli необходим для опосредования экспрессии репортера в сомите, другие регуляторные элементы также должны присутствовать в энхансере, чтобы ограничить его активность эпаксиальным сомитом, либо за счет репрессии активности энхансера в других Shh-чувствительных тканях, таких как нервная трубка, или работая совместно с Glis, чтобы активировать энхансер конкретно в DML. Остается определить, какой фактор транскрипции Gli регулирует активацию энхансера ES. Gli1, Gli2, и Gli3 все экспрессируются в сомитах (Hui et al.1994). У эмбрионов птиц экспрессия трех генов факторов транскрипции Gli инициируется во вновь формирующихся сомитах, непосредственно перед активацией Myf5 , и транскрипты Gli2 и Gli3 локализуются в эпаксиальных мышечных клетках-предшественниках дорсального сомита на участке Myf5. активация (Borycki et al. 2000). Генетические исследования показывают, что Gli1, Gli2 и Gli3 выполняют повторяющиеся функции как в нервном развитии, так и в развитии сомитов у мышей (Mo et al.1997; Мотояма и др. 1998; Park et al. 2000), указывая на то, что эти гены Gli также могут быть избыточными для регуляции Myf5 . Идентификация специфических Glis, которые функционируют вместе с факторами транскрипции сомитов для активации энхансера ES в эпаксиальных предшественниках сомитов, обеспечит основу для понимания молекулярных механизмов, которые контролируют тканевую специфичность сигнальных ответов Shh.

Энхансер ES Myf5 зависит от передачи сигналов Shh для его активации в эпаксиальных миогенных клетках-предшественниках сомитов по всей оси эмбриона, как показано потерей экспрессии энхансера ES / lacZ в сомитах Shh — / — эмбриона.Сомиты Shh мутантных эмбрионов формируются нормально и подвергаются дермотомной эпителизации и образованию DML, но неспособны экспрессировать Myf5 специфически в эпаксиальном сомитном домене. Существенно, что Shh — / — эмбрионы обнаруживают нормальную выживаемость и пролиферацию клеток в дорсальном сомите (Borycki et al. 1999). Следовательно, потеря экспрессии трансгена у мутантных эмбрионов Shh не может быть объяснена дефектами выживания или пролиферации Myf5 -экспрессирующих клеток во вновь образованном сомите.На более поздних стадиях созревания сомитов у мутантных эмбрионов Shh — / — дорсальные аспекты дермотома и миотома отсутствуют. Сходным образом у Myf5 — / — мутантных эмбрионов миграция дорсальных сомитных клеток и образование дермотома и миотома также блокируются (Tajbakhsh et al. 1996b). Наши находки и результаты недавних исследований маркировки клонов (Ordahl et al. 2001) теперь показывают, что клетки DML вносят вклад в дорсальный рост как миотома, так и дермотома. Таким образом, теперь мы можем объяснить отсутствие медиального дермотома и миотома у эмбрионов Shh — / — как специфический дефект в Shh-контролируемой спецификации клеток DML, образующих эти клоны, а не как дегенеративный дефект сомита. созревание.Также примечательно, что активность энхансера ES значительно снижена у эмбрионов Shh +/- , у которых образование и созревание сомитов полностью нормальны, что дополнительно подтверждает специфичность передачи сигналов Shh для регуляции эпаксиального сомита Myf5 . Ранее мы отметили, что экспрессия транскрипта Myf5 , как оценивалась с помощью гибридизации in situ, не была затронута в сомитах эмбрионов Shh +/- (Borycki et al. 1999), что контрастирует с нашими текущими данными о том, что активность энхансера ES , по данным анализа окрашивания β-gal, значительно снижается у Shh +/- эмбрионов.Эти разные результаты могут отражать улучшенную количественную чувствительность анализа окрашивания β-gal в отношении активности трансгена. Альтернативно, транскрипционные или посттранскрипционные компенсаторные механизмы могут модулировать экспрессию Myf5 и в ответ на сниженные уровни Shh, и эти механизмы могут не действовать для трансгена энхансера ES и его транскрипта β-gal.

В дополнение к Shh-зависимой активации Myf5 в эпаксиальных предшественниках сомитов через энхансер ES, Shh-независимые сигналы активируют Myf5 в других линиях мышечных предшественников в эмбрионе.Эта Shh-независимая регуляция опосредуется другими энхансерами транскрипции Myf5 , которые были идентифицированы в области 650 т.п.н. вокруг локуса MRF4 / Myf5 (Zweigerdt et al. 1997; Hadchouel et al. 2000; Summerbell et al. 2000; Карвахал и др. 2001). Эти энхансеры направляют активацию Myf5 в доменах миогенных клеток-предшественников, которые образуют и экспрессируют Myf5 в эмбрионах дикого типа и Shh мутантных эмбрионах, включая клетки-предшественники гипаксиального сомита, конечности и жаберных дуг (Borycki et al. al.1999). Эти энхансеры транскрипции контролируются онтогенетическими сигналами, такими как Wnts (Tajbakhsh et al. 1998). Наши более ранние находки установили, что Myf5 активируется во всех этих доменах мышечных клеток-предшественников, кроме эпаксиального сомитного домена, у 9.75-dpc и 10.50-dpc Shh мутантных эмбрионов (Borycki et al. 1999). В этом исследовании мы исследовали экспрессию Myf5 в более ранних 8.75-dpc Shh мутантных эмбрионах, которые формируют первые сомиты. Эти находки подтверждают нашу более раннюю работу, показывающую, что экспрессия Myf5 и специфически нарушается в сомитах дорсального эпаксиального домена 8.75-dpc Shh мутантные эмбрионы, которые, как сообщалось ранее, экспрессируют низкие уровни Myf5 в медиальном и латеральном доменах сомитов. На основании анализа медиальных и латеральных маркерных генов сомитов, формирование медиально-латерального паттерна сомитов нарушено у мутантных эмбрионов Shh , так что латеральные гены сомитов, включая гипаксиальный Myf5 , экспрессируются медиально, что свидетельствует о низком уровне экспрессии Myf5 в сомиты Shh мутантных эмбрионов отражают активность гипаксиального энхансера Myf5 на этих боковых сигналах.У эмбрионов 8.75 dpc пониженные уровни экспрессии Myf5 также наблюдаются в самых передних четырех затылочных сомитах мутантных эмбрионов Shh , а также мутантных эмбрионов Smoothened ( Smo ), которые имеют дефект по передаче сигналов HH (Чжан и др., 2001). Дистальный энхансер Myf5 , расположенный в области от -58 до -48 kb, активен в затылочных сомитах и ​​может выполнять эту функцию (Hadchouel et al. 2000). Этот же энхансер регулирует экспрессию Myf5 в миотоме медиального сомита и может способствовать низкому уровню экспрессии Myf5 , наблюдаемому в медиальных сомитах Shh — / — эмбрионов (Kruger et al.2001).

Эпаксиальные мышечные предшественники в дорсальном сомите расположены на значительном расстоянии от хорды источника Shh, указывая тем самым, что эпаксиальная экспрессия Myf5 контролируется передачей сигналов Shh на большие расстояния через энхансер ES. Энхансер ES, по-видимому, регулируется положительно и напрямую посредством передачи сигналов Shh, поскольку эта сигнальная активность опосредуется через сайт связывания Gli, который важен для активности энхансера ES. Нарушение этого сайта связывания Gli не приводит к эктопической экспрессии энхансера ES, указывая на то, что этот сайт связывания Gli не используется для подавления экспрессии Myf5 в других Shh-чувствительных тканях, таких как нервная трубка.Транспорт Shh на большие расстояния в сомитах не исследован, но в конечностях передача сигналов Shh на большие расстояния требует N-концевого процессинга и модификации холестерина (Lewis et al. 2001; Zeng et al. 2001). Уровни Shh в отвечающем дорсальном сомите должны быть достаточно высокими, чтобы вызвать положительный регуляторный ответ, который предположительно будет включать ограничение процессинга Gli3 в его репрессорную форму, что, как полагают, происходит в условиях низкоуровневой передачи сигналов Shh ( Wang et al.2000).

Наши результаты экспрессии трансгена энхансера ES показывают, что транскриптов lacZ локализованы в DML как во вновь образованных, так и в зрелых сомитах эмбрионов дикого типа, что указывает на то, что передача сигналов Shh ограничена DML и что активность энхансера не сохраняется, поскольку клетки, отмеченные стойким ферментом β-gal, мигрируют из DML, чтобы сформировать дорсальные аспекты дермотома и миотома. Клетки DML, которые образуют миотом, поддерживают транскрипцию Myf5 , вероятно, за счет активности миотом-специфичного поддерживающего энхансера, расположенного от -58 до -48 kb 5 ‘из Myf5 (Hadchouel 2000).Предположительно устойчивая экспрессия Myf5 под контролем этого поддерживающего энхансера будет способствовать спецификации миотомных предшественников миогенного клона. В клетках DML, которые образуют дермотом, энхансер ES неактивен, и транскрипция Myf5 и прекращается, когда эти клетки становятся коммитированными в клон дермотома. Следовательно, должны существовать специфические механизмы для усиления и локализации передачи сигналов Shh на большие расстояния для активации Gli энхансера Myf5 ES, особенно в предшественниках DML, и для подавления его ответа на передачу сигналов Shh, когда клетки DML мигрируют к дорсальному миотому и дермотому.Одна возможность состоит в том, что сигнальный ответ Shh энхансера ES в DML контролируется противоположными сигналами Shh и BMP, которые, как известно, функционируют вместе в спецификации эпаксиальных и гипаксиальных клеток-предшественников в медиальном и латеральном сомите (рис.). . Когда передача сигналов BMP в сомите заблокирована, экспрессия Myf5 и эктопически экспрессируется по всему дермомиотому; и когда передача сигналов BMP в сомите усиливается, экспрессия Myf5 и в DML подавляется, и гипаксиальные гены активируются эктопически в эпаксиальном домене (Pourquie et al.1996). Кроме того, DML защищен от репрессивной активности BMP в отношении передачи сигналов Shh за счет локальной экспрессии Noggin, мощного ингибитора BMP, который активируется в DML в ответ на передачу сигналов Wnt из дорсальной нервной трубки (Hirsinger et al. 1997; Marcelle и др., 1997 г .; Решеф и др., 1998 г.). У мышей экспрессия Noggin важна для спецификации эпаксиального сомита (McMahon et al. 1998). Согласно этому механизму, локальная экспрессия Noggin или другого ингибитора BMP в DML д. Усиливать ответ этих клеток на низкие уровни сигналов Shh от вентральной хорды.Передача сигналов Shh и активность энхансера ES будут ингибироваться, поскольку клетки DML мигрируют за пределы домена ингибитора BMP с образованием миотома и дермотома. Открытие того, что энхансер Myf5 ES является прямой мишенью для передачи сигналов Shh и регуляции Gli, обеспечивает молекулярный подход для тестирования этой и других моделей функции Shh в формировании паттерна эмбриона и спецификации клеточных клонов.

Модель усиления сигнала для локальной передачи сигналов Shh для спецификации эпаксиальных мышц и дифференцировки дермотома и миотома.Эта модель предполагает, что формирование медиального латерального паттерна дермомиотома в дорсальном сомите контролируется противоположными сигналами Shh и BMP в дорсальном сомите. Противоположные сигналы Shh и BMP также контролируют формирование дорсального вентрального паттерна спецификации нервной трубки (NT) (Roelink et al. 1995) и спецификацию предшественников склеротома в вентральном сомите (McMahon et al. 1998). В дорсальном сомите эпаксиальная миогенная спецификация контролируется индукцией Shh на большом расстоянии Myf5 посредством положительной регуляции Gli энхансера Myf5 ES.Положительная регуляция Gli Myf5 в DML контролируется локализованной экспрессией Noggin, который ингибирует репрессивную активность сигналов BMP, преобладающих в дермомиотоме, тем самым обеспечивая высокую активность передачи сигнала в ответ на низкие уровни Shh от удаленного хорды ( NC). Впоследствии Myf5 -экспрессирующие клетки DML мигрируют дорсально в репрессивную среду с высоким BMP, которая репрессирует активность энхансера ES и экспрессию Myf5 , позволяя этим клеткам принимать судьбу дермотома.Клетки DML, которые мигрируют вентрально латерально, также теряют активность энхансера ES, но эти клетки-предшественники миотома активируют поддерживающий энхансер Myf5 (Hadchouel et al., 2000) для поддержания высокого уровня транскрипции Myf5 , чтобы способствовать их спецификации до линия миотома и их дифференциация с образованием эпаксиальных миотомных мышц.

Материалы и методы

Идентификация энхансера транскрипции эпаксиального сомита Myf5

Библиотека геномной ДНК мыши BAC 129 / SvJ (Genome Systems) была подвергнута скринингу с использованием праймерных зондов Myf5 для ПЦР для идентификации клонов, включая локус MRF4 / Myf5 .Субклоны, которые включали связанные гены MRF4, и Myf5 , были проанализированы путем секвенирования ДНК и трансгенного анализа с использованием репортерных генов lacZ и временной трансгенной инъекции. Экспрессию трансгена оценивали с помощью гистоэнзиматических анализов β-gal на всем образце, а также путем гибридизации целого образца in situ с зондом DIG lacZ , как описано ранее (Goldhamer et al. 1995; Borycki et al. 1999). Репортерный ген lacZ имеет вирусный промотор tk, управляющий транскрипцией гена lacZ , кодирующего β-gal с доменом ядерной локализации (Goldhamer et al.1992). Последовательность ДНК и трансгенные анализы идентифицировали фрагмент Bam HI– Eco R1 длиной 651 п.о. во внутригенной области MRF4 / Myf5 , расположенной на 5 ‘-6,6 т.п.н. промотора Myf5 , непосредственно на 3′ от MRF4, ген и 5 ‘ранее идентифицированного энхансера жаберной дуги (Patapoutian et al. 1993). Эта область была высококонсервативной с внутригенной последовательностью крысы (Pin et al. 1997) и содержала кандидатный сайт связывания Gli, идентифицированный с помощью PatSearch 1.1 программа для поиска по сайту транскрипции. Две трансгенные линии зародышевой линии, несущие энхансер эпаксиального сомита (ES) размером 6,6 т.п.н., E1 и E2, были получены у мышей CD1 для онтогенетических и генетических исследований. Экспрессия трансгена была идентична в обеих трансгенных линиях зародышевой линии, включая экспрессию эпаксиального сомита и мозга, а также эктопическую экспрессию в передней нервной трубке, которая не наблюдалась у транзиторных трансгенных эмбрионов. Эмбрионы были получены от беременных самок в возрасте от 8,0 до 11,5 dpc для окрашивания β-gal в гистоэнзиматических анализах в целом (Goldhamer et al.1995). Эмбрионы были разрезаны поперек вдоль передней и задней оси эмбриона с помощью вибратома. Для генетических исследований гетерозиготных мышей с мутантом Shh (Chiang et al. 1996) на фоне CD1 скрещивали с трансгенными линиями энхансера Myf5 ES, гетерозиготными по трансгену, для получения гомозиготных мутантных мышей Shh , несущих Myf5 . Трансген энхансера ES. Эти линии были выведены для получения гомозиготных и гетерозиготных мутантных эмбрионов Shh для окрашивания β-gal для анализа активности трансгена энхансера Myf5 ES.

Репортерные гены люциферазы и анализы трансфекции ДНК

Myf5 ES-энхансер / репортерные плазмиды люциферазы были созданы путем субклонирования последовательности энхансера Myf5 ES длиной 651 п.н. (Gli mut enh) Gli-связывающий сайт в репортере люциферазы pδ51lucII, который имеет δ-кристаллический промотор с низкой базальной активностью в анализах трансфекции ДНК. 8 × репортерных плазмид Gli / люциферазы были созданы субклонированием в репортер люциферазы pδ51lucII 8 × мультимеров дикого типа (8 × Gli wt , 5′-AACGACCACCAAGAAACA-3 ‘) и мутанта (8 × Gli mut , 5′-AACGACtgCagAGAAACA-3 ‘) Gli-связывающий сайт, присутствующий в энхансере ES из 651 bp Myf5 .Эти мультимеры были получены в виде прямых повторов путем синтеза олигонуклеотидов. Вектор экспрессии Gli2 мыши получали путем субклонирования Gli2 (Sasaki et al. 1999) в векторы-теги pGEM myc, в результате чего получали pGEM Gli2-myc, меченный С-концом.

Анализы трансфекции ДНК

выполняли путем высевания конфлюэнтных культур 3T3 на 6- или 12-луночные планшеты при разведении 1: 6 в среде DMEM с добавлением 10% телячьей сыворотки. Через 18 ч клетки котрансфицировали плазмидой люциферазы Renilla (pRL-TK, Promega; 5% мас. ДНК) и плазмидами-энхансерами люциферазы Myf5, ES или репортерными плазмидами люциферазы 8 × Gli (45%) и Gli1, Gli2, Shh или SmoM2 экспрессирующие плазмиды (50%) с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 (Roche) (1 мкг / лунка в 6-луночных планшетах или 500 нг / лунка в 12-луночных планшетах) в соотношении 3: 1 (об. / Мас. ) реагента к ДНК.Через два часа после добавления ДНК клетки промывали и культивировали в 0,5% сывороточной среде, содержащей форсколин или циклопамин или не содержащую (контроль). Через 24 часа клетки лизировали и проводили анализ люциферазы, как описано ранее (Dhoot et al. 2001). Активность люциферазы в каждом образце культуры нормализовали по активности люциферазы Renilla для корректировки вариаций эффективности трансфекции.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Белок Gli2 был синтезирован с помощью TNT-связанной транскрипции / трансляции (Promega) с использованием плазмиды pGEM – Gli2 – myc в качестве матрицы.Для анализа сдвига электрофоретической подвижности 5 мкл экстрактов трансляции Gli2-myc инкубировали на льду в течение 45 мин с 5 × 10 4 имп / мин 32 P-меченного двухцепочечного олигонуклеотида Gli дикого типа (Gli wt , 5′-GGGAAAAAACGACCACCA AGAAACACAGT-3 ‘) и мутант Gli (Gli mut , 5′-GGGAAAA AACGACtgCagAGAAACACAGT-3′) сайтов связывания в 20 мкл, содержащих 20 мМ Tris (pH 7,9), 1 мМ β NaCl -меркаптоэтанол, 0,1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина и 10% (об. / об.) глицерина.В конкурентных анализах во время предварительной инкубации добавляли 100-кратный избыток немеченого конкурента Gli wt или олигонуклеотида Gli mut . В анализах суперсмещения 4 мкг моноклонального антитела Myc (9E10) добавляли к связывающей смеси на льду в течение 1 ч перед добавлением радиоактивно меченного зонда. Связанные комплексы разделялись электрофорезом на 5% полиакриламидных гелях в 0,25 × буфере ТВЕ, и радиоактивность определялась авторадиографией.

Благодарности

Авторы благодарят Penn Center for Developmental Biology Transgenic Users Group и Дайан Чжоу за производство временных трансгенных эмбрионов, LiYa Yu за отличную техническую помощь и Penn Institute for Human Gene Therapy Mouse Transgenic Core Mouse за производство зародыша. -линии трансгенных мышей.Авторы также благодарят P. Beachy за предоставление вектора экспрессии Activated Smoothened (SmoM2) и образцы циклопамина, Chin Chiang за предоставление мутантных мышей Shh и H. Sasaki за предоставление векторов экспрессии Gli1 и Gli2. Работа финансировалась за счет грантов C.P.E. от Марша десятицентовиков и NICHD.

Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Таким образом, данная статья должна быть помечена как «реклама» в соответствии с разделом 18 USC 1734 исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

Сноски

ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА [email protected]; ФАКС (215) 898-9871.

Статьи и публикации находятся по адресу http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.940702.

Ссылки

  • Александр C, Хасинто A, Ingham PW. Активация транскрипции генов-мишеней hedgehog в Drosophila опосредуется непосредственно белком cubitus interruptus, членом семейства GLI ДНК-связывающих белков цинкового пальца. Genes & Dev. 1996; 10: 2003–2013.[PubMed] [Google Scholar]
  • Ang SL, Россант Дж. HNF-3β необходим для образования узлов и хорды в развитии мышей. Клетка. 1994; 78: 561–574. [PubMed] [Google Scholar]
  • Aza-Blanc P, Ramirez-Weber FA, Laget MP, Schwartz C, Kornberg TB. Протеолиз, который ингибируется hedgehog, направляет белок Cubitus interruptus в ядро ​​и превращает его в репрессор. Клетка. 1997; 89: 1043–1053. [PubMed] [Google Scholar]
  • Bellaiche Y, The I, Perrimon N. Tout-velu является Drosophila, гомологом предполагаемого опухолевого супрессора EXT-1 и необходим для диффузии Hh.Природа. 1998. 394: 85–88. [PubMed] [Google Scholar]
  • Borycki A-G, Mendham L, Emerson CP., Jr. Контроль формирования паттерна сомитов с помощью Sonic hedgehog и его нижележащих генов сигнального ответа. Разработка. 1998; 125: 777–790. [PubMed] [Google Scholar]
  • Borycki AG, Brunk B, Tajbakhsh S, Buckingham M, Chiang C, Emerson CP., Jr Sonic hedgehog контролирует определение эпаксиальных мышц посредством активации Myf5. Разработка. 1999; 126: 4053-4063. [PubMed] [Google Scholar]
  • Борицкий А., Браун А.М., Эмерсон С.П., Jr Shh и Wnt сигнальные пути сходятся, чтобы контролировать активацию гена Gli в сомитах птиц. Разработка. 2000; 127: 2075–2087. [PubMed] [Google Scholar]
  • Бриско Дж., Эриксон Дж. Спецификация нейрональной идентичности с помощью градуированной передачи сигналов Sonic hedgehog. Semin Cell Dev Biol. 1999; 10: 353–362. [PubMed] [Google Scholar]
  • Карвахал Дж. Дж., Кокс Д., Саммербелл Д., Ригби П. У. Трансгенный анализ ВАС локуса Mrf5 / Myf5 выявляет встречно-штыревые элементы, которые контролируют активацию и поддержание экспрессии генов во время развития мышц.Разработка. 2001; 128: 1857–1858. [PubMed] [Google Scholar]
  • Chen CH, von Kessler DP, Park W, Wang B, Ma Y, Beachy PA. Ядерный трафик Cubitus interruptus в регуляции транскрипции экспрессии гена-мишени Hedgehog. Клетка. 1999. 98: 305–316. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чианг К., Литингтунг Й., Ли Э., Янг К.Э., Корден Д.Л., Вестфаль Х., Бичи, штат Пенсильвания. Циклопия и дефект осевого паттерна у мышей, лишенных функции гена sonic hedgehog. Природа. 1996. 383: 407–413. [PubMed] [Google Scholar]
  • Дахманн К., Баслер К.Противопоставление транскрипционных выходов передачи сигналов Hedgehog и закрепленного контроля компартментальной клеточной сортировки на границе Drosophila A / P. Клетка. 2000; 100: 411–422. [PubMed] [Google Scholar]
  • Dai P, Akimaru H, Tanaka Y, Maekawa T., Nakafuku M, Ishii S. Индуцированная Sonic hedgehog активация промотора Gli1 опосредуется GLI3. J Biol Chem. 1999; 274: 8143–8152. [PubMed] [Google Scholar]
  • Daubas P, Tajbakhsh S, Hadchouel J, Primig M, Buckingham M. Myf5 — это новый ранний аксональный маркер в мозге мышей, который подвергается посттранскрипционной регуляции в нейронах.Разработка. 2000; 127: 319–331. [PubMed] [Google Scholar]
  • Dhoot GK, Gustafsson MK, Ai X, Sun W., Standiford DM, Emerson CP., Jr. Регулирование передачи сигналов Wnt и формирование паттерна эмбриона внеклеточной сульфатазой. Наука. 2001; 293: 1663–1666. [PubMed] [Google Scholar]
  • Дин К., Мотояма Дж., Гаска С., Мо Р., Сасаки Х., Россант Дж., Хуэй С.К. Снижение передачи сигналов Sonic hedgehog и отсутствие дифференцировки дна пластинки у мутантных Gli2 мышей. Разработка. 1998; 125: 2533–2543. [PubMed] [Google Scholar]
  • Дюфорт Д., Шварц Л., Харпал К., Россант Дж.Фактор транскрипции HNF3β необходим в висцеральной энтодерме для нормального морфогенеза примитивной полоски. Разработка. 1998; 125: 3015–3025. [PubMed] [Google Scholar]
  • Эриксон Дж., Мортон С., Каваками А., Ролинк Х., Джесселл TM. Два критических периода передачи сигналов Sonic hedgehog необходимы для спецификации моторных нейронов. Клетка. 1996. 87: 661–673. [PubMed] [Google Scholar]
  • Эриксон Дж., Бриско Дж., Рашбасс П., ван Хейнинген В., Джессел Т.М. Градиентная передача сигналов Sonic hedgehog и спецификация клеточной судьбы в вентральной нервной трубке.Колд Спринг Харб Symp Quant Biol. 1997; 62: 451–466. [PubMed] [Google Scholar]
  • Fan CM, Porter JA, Chiang C, Chang DT, Beachy PA, Tessier-Lavigne M. Индукция склеротома дальнего действия с помощью Sonic hedgehog: прямая роль продукта аминоконцевого расщепления и модуляция сигнальный путь циклического АМФ. Клетка. 1995. 81: 457–465. [PubMed] [Google Scholar]
  • Fuse N, Maiti T, Wang B, Porter JA, Hall TM, Leahy DJ, Beachy PA. Белок Sonic hedgehog сигнализирует не как гидролитический фермент, а как очевидный лиганд для патчинга.Proc Natl Acad Sci. 1999; 96: 10992–10999. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Goldhamer DJ, Faerman A, Shani M, Emerson CP., Jr. Регуляторные элементы, которые контролируют специфичную для клонов экспрессию myoD. Наука. 1992; 256: 538–542. [PubMed] [Google Scholar]
  • Goldhamer DJ, Brunk BP, Faerman A, King A, Shani M, Emerson CP., Jr. Эмбриональная активация гена myoD регулируется высококонсервативным дистальным элементом управления. Разработка. 1995; 121: 637–649. [PubMed] [Google Scholar]
  • Гудрич Л.В., Скотт М.П.Ежик и залатал нервную систему и болезнь. Нейрон. 1998; 21: 1243–1257. [PubMed] [Google Scholar]
  • Гудрич Л.В., Джонсон Р.Л., Миленкович Л., МакМахон Дж., Скотт М. Сохранение пути передачи сигналов hedgehog / patched от мух к мышам: индукция гена, патченного мышью, с помощью hedgehog. Genes & Dev. 1996; 10: 301–312. [PubMed] [Google Scholar]
  • Гудрич Л.В., Миленкович Л., Хиггинс К.М., Скотт М.П. Измененные судьбы нервных клеток и медуллобластома у мутантов с заплатой у мышей. Наука.1997. 277: 1109–1113. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hadchouel J, Tajbakhsh S, Primig M, Chang TH, Daubas P, Rocancourt D, Buckingham M. Модульное регулирование myf5 на больших расстояниях выявляет неожиданную гетерогенность между скелетными мышцами эмбриона мыши. Разработка. 2000; 127: 4455–4467. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хан Х., Войновски Л., Миллер Г., Циммер А. Патченный сигнальный путь в онкогенезе и развитии: уроки на животных моделях. J Mol Med. 1999; 77: 459–468. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хеброк М., Ким С.К., Сент-Жак Б., МакМахон А.П., Мелтон Д.А.Регуляция развития поджелудочной железы с помощью передачи сигналов hedgehog. Разработка. 2000; 127: 4905–4913. [PubMed] [Google Scholar]
  • Heemskerk J, DiNardo S. Drosophila hedgehog действует как морфоген в формировании клеточного паттерна. Клетка. 1994; 76: 449–460. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hirsinger E, Duprez D, Jouve C, Malapert P, Cooke J, Pourquie O. Noggin действует после Wnt и Sonic hedgehog, чтобы противодействовать BMP4 в формировании паттерна птичьего сомита. Разработка. 1997; 124: 4605–4614. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hui CC, Slusarski D, Platt KA, Holmgren R, Joyner AL.Экспрессия трех мышиных гомологов гена полярности сегмента Drosophila cubitus interruptus, Gli, Gli-2 и Gli-3, в тканях, происходящих из эктодермы и мезодермы, предполагает множественные роли во время постимплантационного развития. Dev Biol. 1994; 162: 402–413. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ingham PW, Taylor AM, Nakano Y. Роль патченного гена Drosophila в позиционной передаче сигналов. Природа. 1991; 353: 184–187. [PubMed] [Google Scholar]
  • Kinzler KW, Vogelstein B.Ген GLI кодирует ядерный белок, который связывает определенные последовательности в геноме человека. Mol Cell Biol. 1990; 10: 634–642. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Когерман П., Гримм Т., Когерман Л., Краузе Д., Унден А.Б., Сандштедт Б., Тофтгард Р., Зафиропулос П.Г. Супрессор слияния млекопитающих модулирует ядерно-цитоплазматическое перемещение Gli-1. Nat Cell Biol. 1999; 1: 312–319. [PubMed] [Google Scholar]
  • Крюгер М., Меннерих Д., Фис С., Шафер Р., Мундлос С., Браун Т. Ежик Соник — фактор выживания гипаксиальных мышц во время развития мышей.Разработка. 2001; 128: 743–752. [PubMed] [Google Scholar]
  • Lee J, Platt KA, Censullo P, Ruiz i Altaba A. Gli1 является мишенью Sonic hedgehog, которая вызывает развитие вентральной нервной трубки. Разработка. 1997; 124: 2537–2552. [PubMed] [Google Scholar]
  • Льюис П.М., Данн депутат, МакМахон Дж. А., Логан М., Мартин Дж. Ф., Сен-Жак Б., МакМахон А. П.. Модификация холестерина Sonic hedgehog необходима для активности передачи сигналов на большие расстояния и эффективной модуляции передачи сигналов с помощью Ptc1. Клетка. 2001; 105: 599–612.[PubMed] [Google Scholar]
  • Marcelle C, Stark MR, Bronner-Fraser M. Координированные действия BMP, Shh и Noggin опосредуют формирование паттерна дорсального сомита. Разработка. 1997; 124: 3955–3963. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мариго В., Дэйви Р.А., Цзо Й., Каннингем Дж. М., Табин С. Джей. Биохимическое свидетельство того, что пропатчен рецептор Hedgehog. Природа. 1996a; 384: 176–179. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мариго В., Скотт М.П., ​​Джонсон Р.Л., Гудрич Л.В., Табин С.Дж. Консервация в передаче сигналов hedgehog: индукция гомолога цыпленка с помощью Sonic hedgehog в развивающейся конечности.Разработка. 1996b; 122: 1225–1233. [PubMed] [Google Scholar]
  • Матиз М.П., ​​Эпштейн Д.И., Парк Х.Л., Платт К.А., Джойнер А.Л. Gli2 необходим для индукции пластинки дна и соседних клеток, но не для большинства вентральных нейронов центральной нервной системы мышей. Разработка. 1998. 125: 2759–2770. [PubMed] [Google Scholar]
  • McMahon JA, Takada S, Zimmerman LB, Fan CM, Harland RM, McMahon AP. Noggin-опосредованный антагонизм передачи сигналов BMP необходим для роста и формирования паттерна нервной трубки и сомита.Genes & Dev. 1998; 12: 1438–1452. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Мо Р, Фрир А.М., Зиник Д.Л., Крэковер М.А., Мишо Дж., Хенг Х.Х., Чик К.В., Ши Х.М., Цуй Л.К., Ченг С.Х. и др. Специфические и повторяющиеся функции генов цинковых пальцев Gli2 и Gli3 в формировании паттерна и развитии скелета. Разработка. 1997. 124: 113–123. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мотояма Дж., Лю Дж., Мо Р, Дин Кью, Пост М, Хуэй С.К. Важная функция Gli2 и Gli3 в формировании легких, трахеи и пищевода.Нат Жене. 1998. 20: 54–57. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мюнке М., Коэн М.М., мл. Генетические подходы к пониманию развития мозга: голопрозэнцефалия как модель. Ment Retard Dev Disabil Res Rev.2000; 6: 15–21. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мюнстерберг А.Е., Китаевски Дж., Бамкрот Д.А., МакМахон А.П., Лассар А.Б. Комбинаторная передача сигналов членами семейства Sonic hedgehog и wnt индуцирует миогенную экспрессию гена bHLH в сомите. Genes & Dev. 1995; 9: 2911–2922. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ордал С.П., Бердуго Э., Вентерс С.Дж., Денеткло В.Ф.Дорсомедиальная губа дермомиотома управляет ростом и морфогенезом как первичного миотома, так и эпителия дермомиотома. Разработка. 2001; 128: 1731–1744. [PubMed] [Google Scholar]
  • Отт МО, Бобер Э., Лайонс Дж., Арнольд Х., Бакингем М. Ранняя экспрессия миогенного регуляторного гена myf-5 в клетках-предшественниках скелетных мышц эмбриона мыши. Разработка. 1991; 111: 1097–1107. [PubMed] [Google Scholar]
  • Park HL, Bai C, Platt KA, Matise MP, Beeghly A, Hui CC, Nakashima M, Joyner AL.Мутанты Gli1 мыши жизнеспособны, но имеют дефекты передачи сигналов SHH в сочетании с мутацией Gli2. Разработка. 2000; 127: 1593–1605. [PubMed] [Google Scholar]
  • Patapoutian A, Miner JH, Lyons GE, Wold B. Изолированные последовательности из связанных генов Myf-5 и MRF4 управляют различными паттернами мышечно-специфической экспрессии у трансгенных мышей. Разработка. 1993. 118: 61–69. [PubMed] [Google Scholar]
  • Pin CL, Ludolph DC, Cooper ST, Klocke BJ, Merlie JP, Konieczny SF. Дистальные регуляторные элементы контролируют экспрессию гена MRF4 в популяциях ранних и поздних миогенных клеток.Dev Dyn. 1997. 208: 299–312. [PubMed] [Google Scholar]
  • Портер Дж. А., фон Кесслер Д. П., Эккер С. К., Янг К. Э., Ли Дж. Дж., Моисей К., Бичи, штат Пенсильвания. Продукт автопротеолитического расщепления hedgehog активен в локальной и дальнодействующей передаче сигналов. Природа. 1995; 374: 363–366. [PubMed] [Google Scholar]
  • Pourquie O, Fan CM, Coltey M, Hirsinger E, Watanabe Y, Breant C, Francis-West P, Brickell P, Tessier-Lavigne M, Le Douarin NM. Боковые и осевые сигналы, участвующие в формировании паттерна сомитов птиц: роль BMP4.Клетка. 1996. 84: 461–471. [PubMed] [Google Scholar]
  • Рамальо-Сантос М., Мелтон Д.А., МакМахон А.П. Сигналы ежа регулируют множество аспектов развития желудочно-кишечного тракта. Разработка. 2000; 127: 2763–2772. [PubMed] [Google Scholar]
  • Решеф Р., Марото М., Лассар А.Б. Регуляция судьбы дорсальных сомитных клеток: BMP и Noggin контролируют время и характер экспрессии миогенного регулятора. Genes & Dev. 1998. 12: 290–303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Riddle RD, Johnson RL, Laufer E, Tabin C.Sonic hedgehog опосредует поляризующую активность ZPA. Клетка. 1993; 75: 1401–1416. [PubMed] [Google Scholar]
  • Роббинс Д. Д., Нибаккен К. Э., Кобаяши Р., Сиссон Дж. К., Бишоп Дж. М., Теронд П. П.. Hedgehog вызывает передачу сигнала с помощью большого комплекса, содержащего родственный кинезину белок costal2. Клетка. 1997; 90: 225–234. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ролинк Х., Портер Дж. А., Чанг К., Танабе Й., Чанг Д. Т., Бичи, Пенсильвания, Джесселл TM. Индукция дна пластинки и мотонейрона с помощью различных концентраций амино-концевого продукта расщепления автопротеолиза Sonic hedgehog.Клетка. 1995. 81: 445–455. [PubMed] [Google Scholar]
  • Rudnicki MA, Schnegelsberg PN, Stead RH, Braun T, Arnold HH, Jaenisch R. MyoD или Myf-5 необходимы для формирования скелетных мышц. Клетка. 1993; 75: 1351–1359. [PubMed] [Google Scholar]
  • Sasaki H, Hui C, Nakafuku M, Kondoh H. Сайт связывания белков Gli необходим для активности энхансера HNF-3β в донных пластинах трансгенных животных и может отвечать на Shh in vitro. Разработка. 1997; 124: 1313–1322. [PubMed] [Google Scholar]
  • Sasaki H, Nishizaki Y, Hui C-C, Nakafuku M, Kondoh H.Регулирование активности Gli2 и Gli3 с помощью амино-концевого домена репрессии: участие Gli2 и Gli3 в качестве первичных медиаторов передачи сигналов Shh. Разработка. 1999; 126: 3915–3924. [PubMed] [Google Scholar]
  • Sisson JC, Ho KS, Suyama K, Scott MP. Costal2, новый кинезин-родственный белок в сигнальном пути Hedgehog. Клетка. 1997; 90: 235–245. [PubMed] [Google Scholar]
  • Stone DM, Hynes M, Armanini M, Swanson TA, Gu Q, Johnson RL, Scott MP, Pennica D, Goddard A, Phillips H, et al.Патченный ген-супрессор опухолей кодирует кандидатный рецептор для Sonic hedgehog. Природа. 1996. 384: 129–134. [PubMed] [Google Scholar]
  • Саммербелл Д., Эшби П.Р., Коутель О., Кокс Д., Йи С.П., Ригби П.В. Экспрессия Myf5 в развивающемся эмбрионе мыши контролируется дискретными и диспергированными энхансерами, специфичными для определенных популяций предшественников скелетных мышц. Разработка. 2000; 127: 3745–3751. [PubMed] [Google Scholar]
  • Тайпале Дж., Чен Дж. К., Купер М.К., Ван Б., Манн Р.К., Миленкович Л., Скотт М.П., ​​Бичи, штат Пенсильвания.Эффекты онкогенных мутаций в Smoothened и Patched могут быть отменены циклопамином. Природа. 2000; 406: 1005–1009. [PubMed] [Google Scholar]
  • Tajbakhsh S, Bober E, Babinet C, Pournin S, Arnold H, Buckingham M. Ген, нацеленный на локус myf-5 с помощью nlacZ, выявляет экспрессию этого миогенного фактора в зрелых волокнах скелетных мышц, а также ранняя эмбриональная мышца. Dev Dyn. 1996a; 206: 291–300. [PubMed] [Google Scholar]
  • Тайбахш С., Роканкур Д., Бэкингем М. Клетки-предшественники мышц, не отвечающие на позиционные сигналы, принимают немиогенные судьбы у мышей с нулевым myf5.Природа. 1996b; 384: 266–270. [PubMed] [Google Scholar]
  • Tajbakhsh S, Rocancourt D, Cossu G, Buckingham M. Новое определение генетических иерархий, контролирующих миогенез скелета: Pax-3 и Myf-5 действуют выше MyoD. Клетка. 1997. 89: 127–138. [PubMed] [Google Scholar]
  • Tajbakhsh S, Borello U, Vivarelli E, Kelly R, Papkoff J, Duprez D, Buckingham M, Cossu G. Дифференциальная активация Myf5 и MyoD разными Wnts в эксплантатах параксиальной мезодермы мыши и более поздняя активация миогенеза в отсутствие Myf5.Разработка. 1998; 125: 4155–4162. [PubMed] [Google Scholar]
  • Тейлор С.М., Джонс, Пенсильвания. Множественные новые фенотипы индуцированы в клетках 10T1 / 2 и 3T3, обработанных 5-азацитидином. Клетка. 1979; 17: 771–779. [PubMed] [Google Scholar]
  • Тейе М., Ватанабе Й., Джеффс П., Дюпре Д., Лапойнт Ф., Ле Дуарен Н.М. Sonic hedgehog необходим для выживания как миогенных, так и хондрогенных сомитных клонов. Разработка. 1998; 125: 2019–2030. [PubMed] [Google Scholar]
  • van den Heuvel M, Ingham PW.Smoothened кодирует рецептор-подобный серпентиновый белок, необходимый для передачи сигналов hedgehog. Природа. 1996; 382: 547–551. [PubMed] [Google Scholar]
  • Фон Олен Т., Лессинг Д., Нусс Р., Хупер Дж. Э. Передача сигналов Hedgehog регулирует транскрипцию через cubitus interruptus, специфичный для последовательности ДНК-связывающий белок. Proc Natl Acad Sci. 1997; 94: 2404–2409. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Ван Б., Фаллон Дж. Ф., Бичи, штат Пенсильвания. Hedgehog-регулируемый процессинг Gli3 продуцирует передний / задний градиент репрессоров в развивающихся конечностях позвоночных.Клетка. 2000; 100: 423–434. [PubMed] [Google Scholar]
  • Wechsler-Reya RJ, Scott MP. Контроль пролиферации предшественников нейронов в мозжечке с помощью Sonic hedgehog. Нейрон. 1999; 22: 103–114. [PubMed] [Google Scholar]
  • Вайнштейн, округ Колумбия, Руис и Альтаба, А. Чен, Худлесс П., Презиозо В.Р., Джессел Т.М., Дарнелл Дж. Фактор транскрипции крылатой спирали HNF-3 β необходим для развития хорды у эмбриона мыши. Клетка. 1994; 78: 575–588. [PubMed] [Google Scholar]
  • Цзэн X, Гетц Дж. А., Субер Л. М., Скотт В. Дж., Младший, Шрейнер К. М., Роббинс Д. Д..Свободно диффундирующая форма Sonic hedgehog обеспечивает передачу сигналов на большие расстояния. Природа. 2001; 411: 716–720. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhang XM, Ramalho-Santos M, McMahon AP. Сглаженные мутанты обнаруживают повторяющиеся роли для передачи сигналов Shh и Ihh, включая регуляцию L / R асимметрии с помощью узла мыши. Клетка. 2001; 105: 781–792. [PubMed] [Google Scholar]
  • Цвайгердт Р., Браун Т., Арнольд Х. Х. Для достоверной экспрессии гена Myf-5 во время миогенеза мышей требуются отдаленные контрольные области: трансгенный подход с использованием искусственных хромосом дрожжей.Dev Biol. 1997; 192: 172–180. [PubMed] [Google Scholar]

Экспрессия shh в сетчатке рыбок данио. На всех панелях показаны конфокальные …

Контекст 1

… точно определить клетки, которые экспрессируют shh в сетчатке рыбок данио, мы сравнили экспрессию в сетчатке shh РНК с новой трансгенной линией, экспрессирующей GFP под контролем shh Promoter (см. Материалы и методы). Мы обнаружили, что и shh РНК, и shh-GFP экспрессируются не только в GCL, но и в проксимальной части INL (рис….

Контекст 2

… далее сравнили экспрессию shh-GFP с Isl1, фактором транскрипции LIM / гомеодомена, который экспрессируется в ряде нейрональных клеток и был обнаружен в GCL и в субпопуляции амакриновых клеток сетчатки грызунов (Thor et al., 1991; Galli-Resta et al., 1997). Мы обнаружили, что с помощью этого подхода можно обнаружить четыре типа RGC: те, которые экспрессируют либо shh-GFP, либо Isl1, те, которые экспрессируют оба, и те, которые не экспрессируют ни один (рис.1G-I). Мы также обнаружили, что амакриновые клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, отличаются от амакриновых клеток, экспрессирующих Isl1 (Рис. …

Контекст 3

… далее сравнили экспрессию shh-GFP с Isl1, LIM Фактор транскрипции гомеодомена, который экспрессируется в ряде нейрональных клеток и был обнаружен в GCL и в субпопуляции амакриновых клеток в сетчатке грызунов (Thor et al., 1991; Galli-Resta et al., 1997). Мы обнаружили, что с помощью этого подхода можно обнаружить четыре типа RGC: те, которые экспрессируют либо shh-GFP, либо Isl1, те, которые экспрессируют оба, и те, которые не экспрессируют ни один (рис.1G-I). Мы также обнаружили, что амакриновые клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, отличаются от амакриновых клеток, экспрессирующих Isl1 (Рис. …

Контекст 4

… далее характеризует клетки, экспрессирующие shh-GFP в сетчатке. , мы сравнили распределение антигена Zn5, который маркирует RGC, с shh-GFP (рис. 1B, C). Клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, демонстрируют типичную морфологию амакриновых клеток (рис. 1C). Мы также обнаруживаем GFP во внутреннем плексиформном слое (IPL) из-за присутствия нейритов из амакриновых клеток, экспрессирующих shh-GFP (рис….

Контекст 5

… дополнительно охарактеризовав клетки, экспрессирующие shh-GFP в сетчатке, мы сравнили распределение антигена Zn5, который маркирует RGC, с shh-GFP (рис. 1B, C). Клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, демонстрируют типичную морфологию амакриновых клеток (рис. 1C). Мы также обнаруживаем GFP во внутреннем плексиформном слое (IPL) из-за присутствия нейритов из амакриновых клеток, экспрессирующих shh-GFP (рис. …

Context 6

… Чтобы дополнительно охарактеризовать клетки, экспрессирующие shh-GFP в сетчатке, мы сравнили распределение антигена Zn5, который маркирует RGC, с shh-GFP (рис. 1B, C). Клетки, экспрессирующие shh-GFP в INL, демонстрируют типичную морфологию амакриновых клеток (рис. 1C). Мы также обнаруживаем GFP во внутреннем плексиформном слое (IPL) из-за присутствия нейритов из амакриновых клеток, экспрессирующих shh-GFP (рис. …

Контекст 7

… сетчатка грызунов, Isl1 экспрессируется как в подмножестве RGC, так и в подмножестве амакриновых клеток в проксимальном INL (Thor et al., 1991; Галли-Реста и др., 1997). Мы находим сходные домены экспрессии Isl1 в сетчатке рыбок данио (Fig. 1D, Fig. 4A). Кроме того, мы также обнаруживаем две отдельные группы Isl1-положительных клеток в дистальном INL через 64 ​​hpf, которые не были описаны ранее, и которые, по-видимому, представляют собой биполярные клетки и горизонтальные клетки (рис. 4A). У shh мутантных эмбрионов мы наблюдаем общее снижение Isl1-позитивных клеток через 64 ​​hpf, и большинство этих клеток обнаруживается в проксимальных отделах сетчатки (Fig. 4B). Количество Isl1-положительных клеток в GCL мутантных эмбрионов shh значительно снижено по сравнению с GCL дикого типа (рис.4A, B), что согласуется с наблюдением, что количество Zn5-позитивных RGCs также сильно снижено у shh мутантных эмбрионов (Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000). Кроме того, другие типы клеток, экспрессирующих Isl1, также сильно редуцированы или отсутствуют, а ламинарная организация клеток, экспрессирующих Isl1, серьезно нарушена у мутантов shh (Рис. …

Sonic Hedgehog, ключевой ген развития, испытавший усиление молекулярная эволюция приматов | Human Molecular Genetics

Аннотация

Sonic Hedgehog ( SHH ) — один из наиболее интенсивно изучаемых генов в биологии развития.Это высококонсервативный ген, встречающийся у таких разнообразных видов, как членистоногие и млекопитающие. У млекопитающего SHH кодирует сигнальную молекулу, которая играет центральную роль в формировании паттерна развития, особенно нервной системы и скелетной системы. Здесь мы показываем, что молекулярная эволюция SHH заметно ускоряется у приматов по сравнению с другими млекопитающими. Мы также показываем, что у приматов ускорение наиболее заметно по линии, ведущей к человеку. Наконец, мы показываем, что ускорение родословной, ведущей к человеку, связано с признаками адаптивной эволюции.В частности, линия, ведущая к человеку, характеризуется безудержным и статистически весьма неслучайным увеличением серинов и треонинов, остатков, которые являются потенциальными субстратами посттрансляционных модификаций. Это указывает на то, что SHH , возможно, развил более сложную посттрансляционную регуляцию в клонах, ведущих к человеку. В совокупности эти результаты предполагают, что SHH является потенциальным участником эволюции специфических для приматов или человека морфологических особенностей нервной и / или скелетной систем и дает импульс для дополнительных исследований, направленных на определение функций, специфичных для приматов или человека. этого ключевого гена развития.

ВВЕДЕНИЕ

Приматы и особенно люди обладают рядом морфологических особенностей, которые отличают их от других видов. Многие из них, такие как увеличенный мозг, прямая осанка, противопоставление большого пальца и уменьшенное лицо, относятся к эволюционным изменениям в нервной системе и скелетной системе. Следовательно, разумно постулировать, что гены развития, участвующие в формировании паттерна нервной и скелетной систем, могли играть важную роль в эволюции фенотипов, специфичных для приматов или человека (1,2).

Ген SHH млекопитающих кодирует сигнальную молекулу, которая играет центральную роль в формировании паттерна развития нервной и скелетной систем (3). В частности, было показано, что SHH играет критическую роль в формировании паттерна головного мозга, спинного мозга, черепно-лицевых элементов, осевого скелета, конечностей и пальцев (3), все это структуры, которые претерпели заметные морфологические изменения в ходе эволюции. приматов, особенно людей.

Во время эмбрионального развития SHH экспрессируется из сильно ограниченного набора клеток в хорде, нервной трубке и зачатках конечностей.Белковый продукт SHH подвергается автокаталитическому расщеплению с образованием N-концевого пептида, известного как SHH-N. Реакция расщепления сочетается с ацилированием жирных кислот на обоих концах пептида. Затем ацилированный SHH-N секретируется из исходных клеток и действует как диффузная сигнальная молекула, которая управляет морфогенезом последующих клеток (4,5). Автокаталитическая активность SHH полностью проявляется в карбоксильной части белка, известной как SHH-C (5). О критической функции этого домена свидетельствует тот факт, что люди, гетерозиготные по мутациям потери функции в SHH-C, страдают голопроэнцефалией, состоянием, характеризующимся сильно уменьшенным размером мозга, слиянием двух полушарий переднего мозга и дефектами черепно-лицевых элементов (6). .Белковая последовательность сигнальной молекулы SHH-N чрезвычайно консервативна у млекопитающих и даже у млекопитающих и членистоногих. Напротив, домен автообработки SHH-C гораздо более различается среди таксонов. В этом исследовании мы исследуем молекулярную эволюцию SHH , фокусируясь на области, кодирующей SHH-C. Мы показываем, что скорость несинонимичных изменений значительно ускоряется у приматов, особенно в родословной, ведущей к человеку. Мы также показываем, что паттерн изменения последовательности согласуется с адаптивной эволюцией.Таким образом, наши данные предполагают, что SHH , возможно, способствовал эволюции специфичных для приматов или человека морфологических особенностей нервной и / или скелетной систем.

РЕЗУЛЬТАТЫ

SHH Эволюция в различных отрядах млекопитающих

Скорость эволюции белковой последовательности в пересчете на скорость нейтральных мутаций обычно оценивается отношением несинонимичных ( K a ) к синонимичным ( K s ) скоростей замен.Сначала мы вычислили соотношение K a / K s SHH C у катарринных приматов, сравнив ортологические последовательности между человеком и макакой обезьяны Старого Света (OWM). Затем мы исследовали соотношение K a / K s у четырех отрядов млекопитающих, не относящихся к приматам: грызунов (путем сравнения ортологов мышей и крыс), парнокопытных (овец и корова), периссодактилей (зебры и носороги) и хищники (кошка и собака).Мы также исследовали обезьян Нового Света (NWM) (также известных как platyrrhines, который является кладой приматов, более базальной по сравнению с катаррином), сравнивая ортологи белки и совы. Мы обнаружили, что среди этих шести пар видов, K a / K s , безусловно, является самым высоким среди приматов катарального типа (рис. 1A). Разница в частоте катаральных инфекций и других млекопитающих статистически высока ( P <0,002 по двустороннему точному критерию Фишера), тогда как различия между другими млекопитающими незначительны.Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что скорость эволюции белковой последовательности SHH-C значительно ускорена у катарринов по сравнению с другими млекопитающими.

Рисунок 1.

Молекулярная эволюция SHH C у различных млекопитающих. ( A ) Отношения K a / K s в шести парных сравнениях. Незакрашенная полоса представляет K a / K s между парой видов, указанной под каждой полосой, сплошная полоса представляет K a / K s либо ветви человека, либо ветви макаки, ​​поскольку их отклонение от последних предков катарана.( B ) Анализ методом скользящего окна K a / K s для тех же шести пар видов.

Рис. 1.

Молекулярная эволюция SHH C у различных млекопитающих. ( A ) Отношения K a / K s в шести парных сравнениях. Незакрашенная полоса представляет K a / K s между парой видов, указанной под каждой полосой, сплошная полоса представляет K a / K s либо ветви человека, либо ветви макаки, ​​поскольку их отклонение от последних предков катарана.( B ) Анализ методом скользящего окна K a / K s для тех же шести пар видов.

Затем мы выполнили анализ в скользящем окне, чтобы выяснить, сосредоточено ли ускорение катарринов в определенных субрегионах гена или оно распределено более равномерно. Этот анализ выявил 5′-подобласть, где K a / K s исключительно высока только у катарринов, но близка к фоновому уровню у всех других млекопитающих (рис.1Б). Более того, в этой подобласти catarrhine K a / K s превышает 1, что указывает на положительный отбор (7), хотя это само по себе не является окончательным доказательством положительного отбора. Несмотря на высокую скорость эволюции, этот субрегион явно функционально важен для человеческого развития, поскольку миссенс-мутации внутри субрегиона приводят к голопрозэнцефалии (6). Существует также подобласть 3 ‘, которая показывает высокие значения K a / K s у большинства видов, что указывает на его высокую изменчивость по таксонам (рис.1Б).

SHH Эволюция приматов

Чтобы выяснить, происходит ли ускорение скорости катарринов преимущественно на человеческой ветви или ветви OWM, мы использовали два вида NWM в качестве внешних групп для назначения нуклеотидных замен человека-OWM на любую из ветвей. Примечательно, что ускорение катарринов почти полностью связано с человеческой ветвью (рис. 1А). Отношение K a / K s ветви OWM лишь умеренно выше, чем у некатаринных млекопитающих.Напротив, K a / K s человеческой ветви в 4-10 раз больше, чем любой из других исследованных видов, статистически значимое несоответствие ( P <0,001).

Затем мы получили последовательности SHH C у дополнительных приматов, представляющих ключевые позиции филогении приматов, включая четырех человекообразных обезьян (шимпанзе, горилла, орангутан и гиббон) и прозимиана (лемура) (для выравнивания см. Дополнительные материалы. , Рис.S1). Используя все доступные последовательности приматов, мы построили два филогенетических дерева: одно отображает скорость синонимичных замен (рис. 2A), а другое — скорость несинонимичных изменений (рис. 2B). Мы обнаружили, что скорости синонимичных замен примерно сопоставимы в различных ветвях со скромными уровнями колебаний, хотя ветвь OWM кажется несколько выше, чем другие ветви, что может быть связано с более высокой частотой мутаций в OWM, как сообщалось ранее (8). Напротив, несинонимичные показатели варьируются между ветвями систематическим образом, при этом линия передачи от последних обезьяньих предков к людям показывает значительно больше замен, чем другие ветви.Этот образец отражает продолжающееся ускорение эволюции по линии, ведущей к человеку. Для дальнейшего изучения этого ускорения были выполнены два анализа. Сначала было рассчитано K a / K s для каждой ветви филогенетического дерева приматов (рис. 2B). Он показал, что ветви с наивысшими значениями K, и / K s располагаются вдоль линии, ведущей к человеку (выделено на рис. 2B). В частности, внутренняя ветвь между последними предками катаринов и последними предками обезьян имеет отношение K a / K s , намного большее 1, что предполагает (хотя и не доказывает) положительный отбор.Во-вторых, мы выполнили серию парных сравнений последовательностей, каждая пара состояла из человека и другого приматы. Используя следующего ближайшего приматы в качестве внешней группы, мы назначили замены оснований между человеком и другим приматом на любую эволюционную ветвь. Это показало, что независимо от того, какой примат сравнивался с человеком, K a / K s последовательно выше в ветви, ведущей к человеку, чем в ветви, ведущей к другому примату (данные не показаны).В совокупности эти наблюдения показывают, что в пределах филогенетического дерева приматов скорость замены аминокислот SHH-C специфически и резко повышается в линии передачи от последних обезьяньих предков к людям.

Рис. 2.

Молекулярная эволюция SHH C у приматов. ( A и B ) Филогенетическое дерево, основанное на синонимичных (A) или несинонимичных (B) заменах, с горизонтальным расстоянием, представляющим количество замен, скорректированных на множественные совпадения и смещение перехода / трансверсии.В (B) соотношение K и / K s указано над каждой ветвью, а линия, ведущая к людям (то есть от последних обезьяньих предков до людей), выделена жирным шрифтом. ( C ) Безудержное увеличение серинов / треонинов в линии, ведущей к человеку. Прирост (+) или потеря (-) серинов (S) или треонинов (T) указаны над каждой ветвью. Длины ответвлений показаны произвольно.

Рис. 2.

Молекулярная эволюция SHH C у приматов.( A и B ) Филогенетическое дерево, основанное на синонимичных (A) или несинонимичных (B) заменах, с горизонтальным расстоянием, представляющим количество замен, скорректированных на множественные совпадения и смещение перехода / трансверсии. В (B) соотношение K и / K s указано над каждой ветвью, а линия, ведущая к людям (то есть от последних обезьяньих предков до людей), выделена жирным шрифтом. ( C ) Безудержное увеличение серинов / треонинов в линии, ведущей к человеку.Прирост (+) или потеря (-) серинов (S) или треонинов (T) указаны над каждой ветвью. Длины ответвлений показаны произвольно.

Безудержное и статистически весьма неслучайное увеличение серинов / треонинов в линии, ведущей к человеку

Классический и наиболее часто используемый метод обнаружения положительного отбора — проверить, превышает ли скорость аминокислотных изменений в гене нейтральное ожидание. Другой подход состоит в том, чтобы спросить, являются ли типы аминокислотных замен в высшей степени неслучайными по сравнению с нейтральным ожиданием (9).С этой целью мы проверили все замены аминокислот в SHH-C, которые произошли у приматов. Удивительно, но среди 13 замен между последними обезьяньими предками и современными людьми восемь привели к добавлению серинов или треонинов, остатков, которые являются потенциальными субстратами ковалентных посттрансляционных модификаций (обсуждаемых ниже), но ни один из них не привел к потере серина или треонин (рис. 2С).

Это наблюдение кажется в высшей степени неслучайным. Чтобы оценить его количественно, мы провели два статистических анализа.Во-первых, мы предположили модель, в которой несинонимичные изменения в SHH C считаются выборочно нейтральными; Затем мы рассчитали вероятность того, что 13 несинонимичных замен в гене приведут к увеличению количества серинов / треонинов на восемь или более (см. «Материалы и методы»). Этот анализ показал, что наблюдаемое увеличение серинов / треонинов является значительным отклонением от нейтрального ожидания ( P <0,0001). Во втором анализе мы сравнили SHH-C с эмпирическими данными.В линии от последних предков катарана до человека имеется 10 замен аминокислот, что приводит к увеличению количества серинов / треонинов на шесть. Учитывая доступность полногеномных последовательностей человека, макака и мыши, мы смогли изучить усиление или потерю серинов / треонинов для большого количества генов в линии от последних предков катаррина до человека. Используя 2939 генов, которые содержали по крайней мере шесть аминокислотных замен в указанной линии, мы получили эмпирическое распределение скоростей, с которыми гены набирали или теряли серины / треонины (рис.3). SHH-C является явным выбросом в этом распределении ( P <0,001), демонстрируя, что его безудержное увеличение серинов / треонинов в высшей степени неслучайно даже по сравнению с эмпирическими данными. Мы также отмечаем, что единственными другими ветвями приматов на рис. 2C, для которых SHH-C приобрел или потерял какие-либо серины / треонины, являются ветвь OWM (приобретающая один серин и один треонин, но теряющая два серина в других положениях) и ветвь NWM. (получение одного серина). Кроме того, ни одна из замен аминокислот в SHH-C между двумя видами NWM, использованными в этом исследовании (т.е. беличья обезьяна и сова) включает серин или треонин (данные не показаны). Таким образом, безудержное увеличение серинов / треонинов является отличительной чертой эволюции SHH-C в линии приматов, ведущей к человеку. Значительное отклонение этого открытия от нейтрального ожидания и эмпирических наблюдений за другими генами дает убедительный аргумент в пользу того, что положительный отбор ответственен за увеличение серинов / треонинов.

Рисунок 3.

Скорость увеличения или потери серинов / треонинов в 2939 генах. Уровень каждого гена рассчитывается как количество чистого прироста (+) или чистой потери (-) серинов / треонинов в линии от последних предков катарана до человека, деленное на общее количество замен аминокислот в этой линии. Гены объединяются в соответствии с их ставками. Средняя скорость каждого интервала указывается на оси x , а диапазон каждого интервала — от медианы минус 0,05 (включительно) до медианы плюс 0.05 (эксклюзив).

Рисунок 3.

Скорость увеличения или потери серинов / треонинов в 2939 генах. Уровень каждого гена рассчитывается как количество чистого прироста (+) или чистой потери (-) серинов / треонинов в линии от последних предков катарана до человека, деленное на общее количество замен аминокислот в этой линии. Гены объединяются в соответствии с их ставками. Средняя скорость каждого интервала указывается на оси x , а диапазон каждого интервала — от медианы минус 0.От 05 (включительно) до медианы плюс 0,05 (без учета).

Гликозилирование и фосфорилирование серинов или треонинов — хорошо зарекомендовавшие себя средства посттрансляционной регуляции (10,11). Вычислительный анализ восьми серинов и треонинов, добавленных в линию от последних обезьяньих предков к человеку, предполагает, что четыре являются потенциальными сайтами гликозилирования, а три — потенциальными сайтами фосфорилирования (дополнительный материал, рис. S1). Учитывая, что SHH является секретируемым белком, гликозилирование может быть более вероятным из двух возможных (10).Мы отмечаем, что SHH-C у мышей и кур действительно подвергается гликозилированию (12). Кроме того, трехмерная структура in silico , сконструированная для частичного полипептида SHH-C человека, показала, что сайты добавлений серина / треонина появляются в областях, стерически доступных для потенциальных модификаций (данные не показаны). Наконец, мы отмечаем, что точечная мутация человека, которая, как известно, нарушает функцию SHH и вызывает голопроэнцефалию, располагается непосредственно перед добавленным серином (6), и что мутация, по прогнозам, нарушает гликозилирование этого серина (дополнительный материал, рис.S1). Эти наблюдения подтверждают возможность того, что SHH развил более сложные посттрансляционные модификации в линии, ведущей к человеку.

Полиморфизм человека по локусу

SHH

Одним из признаков недавнего положительного отбора является подавленный полиморфизм с избытком редких аллелей в пораженном локусе (13). Чтобы оценить, демонстрирует ли SHH такую ​​сигнатуру, мы секвенировали область размером 25 т.п.н., охватывающую ген, в панели из 42 человек (84 хромосомы) из различных популяций.Гетерозиготность ( π ) транскрибируемой области размером 10 т.п.н. SHH составляет 0,0004 (0,0005, если исключить кодирующую последовательность), что намного ниже, чем в среднем по геному 0,0008–0,001 (14–17). Таджима D той же области составляет -0,9 (-0,7, если кодирующая последовательность исключена). Отрицательный показатель D Таджимы указывает на избыток редких аллелей относительно нейтрального ожидания и, аналогичный низкой гетерозиготности, также является признаком недавнего положительного отбора (18). Таким образом, значения как гетерозиготности, так и значения D Tajima в транскрибируемой области SHH наводят на мысль о положительном отборе этого гена во время недавней эволюции человека.Чтобы исследовать эту возможность в дальнейшем, мы выполнили анализ скользящего окна на гетерозиготность и D Tajima вдоль области 25 kb, окружающей локус SHH (Рис. 4). Мы обнаружили две области особенно выраженной депрессии для обоих этих параметров: одна соответствует экзону 3, который кодирует весь SHH-C, а другая — интрону 1, который содержит важные энхансерные элементы (19). Эти депрессии являются выбросами по сравнению с набором нейтрально эволюционирующих областей генома, недавно исследованных на популяционной панели, сопоставимой с нашей (16) (рис.4). Хотя эти депрессии не обеспечивают окончательного доказательства положительного отбора в свете сложной демографической истории людей (20), они, тем не менее, наводят на мысль о недавних избирательных ударах, которые возникли в результате положительного отбора, действующего в локусе SHH (13).

Фигура 4. Профиль полиморфизма

области 21 т.п.н., охватывающей локус SHH человека. На верхней панели изображена геномная структура SHH .На следующих трех панелях в порядке убывания изображены анализы в скользящем окне сохранения последовательности между человеком и мышью, гетерозиготности ( π ) у людей и D Таджимы у людей. Низкое значение π указывает на низкий уровень полиморфизма, тогда как низкое значение D Tajima указывает на избыток редких аллелей. Толстые сплошные линии и пунктирные линии на двух нижних панелях изображают среднее и стандартное отклонение, соответственно, для недавно изученного набора нейтрально развивающихся геномных областей размером 2–3 т.п.н. (16).Кодирующие части экзонов выделены.

Фигура 4.

Профиль полиморфизма области 21 т.п.н., охватывающей локус SHH человека. На верхней панели изображена геномная структура SHH . На следующих трех панелях в порядке убывания изображены анализы в скользящем окне сохранения последовательности между человеком и мышью, гетерозиготности ( π ) у людей и D Таджимы у людей. Низкое значение π указывает на низкий уровень полиморфизма, тогда как низкое значение D Tajima указывает на избыток редких аллелей.Толстые сплошные линии и пунктирные линии на двух нижних панелях изображают среднее и стандартное отклонение, соответственно, для недавно изученного набора нейтрально развивающихся геномных областей размером 2–3 т.п.н. (16). Кодирующие части экзонов выделены.

Молекулярная эволюция других представителей семейства

Hedgehog

SHH — один из трех генов семейства Hedgehog млекопитающих. Два других — это Indian Hedgehog ( IHH ) и Desert Hedgehog ( DHH ).Мы получили последовательности IHH и DHH у человека, макака, мыши, крысы и нескольких других видов приматов и неприматов. Мы обнаружили, что эти два гена высоко консервативны у этих различных видов (данные не показаны). Таким образом, ускоренная эволюция SHH в линии приматов, ведущей к человеку, по-видимому, является отличительной чертой этого члена семейства Hedgehog .

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы показали, что молекулярная эволюция ключевого гена развития SHH (более конкретно, его домена автообработки) резко ускоряется у приматов по сравнению с другими млекопитающими.У приматов ускорение наиболее заметно по линии, ведущей к человеку. Особенно поразительным является наблюдение, что линия, ведущая к человеку, характеризуется безудержным и статистически весьма неслучайным увеличением серинов и треонинов. Наконец, определенные особенности полиморфизма в локусе SHH у людей, такие как депрессивная гетерозиготность и D Tajima, согласуются с сигнатурами недавних положительных выборочных обследований.

Мы утверждаем, что в совокупности эти наблюдения указывают на положительный отбор, а не на ослабление функциональных ограничений, по следующим причинам.Во-первых, потеря одной функциональной копии SHH у человека приводит к глубоким аномалиям развития мозга и черепно-лицевых элементов (6). Для сравнения, потеря одной копии SHH у мышей не имеет детектируемого фенотипа (21). Эти наблюдения согласуются с критической важностью SHH для развития человека и не поддерживают функциональное расслабление. Во-вторых, как показано на рисунке 1C, более высокая скорость эволюции SHH у приматов в значительной степени связана с локальным увеличением скорости в небольшой подобласти гена, где K a / K s превышает 1 у приматов, но очень низкий у всех других исследованных млекопитающих.Это выступает против ослабления ограничений в масштабах всего гена и вместо этого предполагает адаптивную эволюцию в этом субрегионе. Функциональная важность этого субрегиона для человеческого развития дополнительно подтверждается тем фактом, что миссенс-мутации в этом субрегионе приводят к голопрозэнцефалии (6). В-третьих, большинство замен аминокислот по линии приматов, ведущих к человеку, приводит к добавлению серинов или треонинов, остатков, которые потенциально могут быть модифицированы гликозилированием или фосфорилированием.Статистический тест показал, что такой резкий рост серинов и треонинов является значительным отклонением от нейтральных ожиданий; это также выброс по сравнению с эмпирическими данными, собранными на большом количестве генов в геноме. В высшей степени неслучайный характер этого шаблона замены аминокислот явно несовместим с ослабленным ограничением (что должно привести к гораздо более случайному шаблону замены) и вместо этого поддерживает функциональное значение этих замен.Резкое увеличение количества серинов / треонинов в SHH-C в эволюционной линии, ведущей к человеку, предполагает, что SHH-C человека может подвергаться более сложным посттрансляционным модификациям, которые, в свою очередь, могут привести к более сложной регуляции SHH- Производство N. Интересно, что замены серина / треонина в гомеотическом гене Ubx , как недавно было показано, имеют решающее значение для эволюционной модификации строения тела насекомых (22). Наконец, паттерны полиморфизма человеческого локуса SHH наводят на мысль о недавних положительных селективных сканированиях в этом локусе.В совокупности эти многочисленные доказательства убедительно доказывают, что SHH претерпел адаптивную эволюцию в линии приматов, ведущей к человеку.

SHH центрально участвует в формировании паттерна множества тканей, в первую очередь нервной системы (включая головной и спинной мозг) и скелетной системы (включая черепно-лицевые элементы, осевой скелет, конечности и пальцы) (3). Его ускоренные и весьма необычные паттерны молекулярной эволюции в линии, ведущей к человеку, могут поэтому иметь отношение к появлению определенных специфических для приматов или человека особенностей в нервной и / или скелетной системах, что потенциально может быть проверено в будущих исследованиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор и анализ последовательности

Геномная ДНК была получена от следующих видов: обыкновенного шимпанзе ( Pan troglodytes ), низинной гориллы ( Gorilla gorilla ), орангутанга ( Pongo pygmaeus ), белорукого гиббона ( Hylobates lar ), крабоеда. макака ( Macaca fascicularis ) *, боливийская обезьяна-белка ( Saimiri boliviensis ) *, обезьяна-сова ( Aotus spp .) *, черно-белый лемур ( Varecia variegata variegata ) *, овца ( Ovis aries ) *, корова ( Bos taurus ) *, домашняя кошка ( Felis cattus ) *, домашняя собака ( Canis фамильяр ) *, зебра Гранта (Equus burchelli boehmi ) * и северный белый носорог ( Ceratotherium simum cottoni ) *. Тотальную РНК также экстрагировали из образцов мозга, если они были доступны (обозначены звездочками), и примировали случайными гексамерами или поли (Т) олигомерами для синтеза кДНК первой цепи.Стандартные условия ПЦР использовали для амплификации SHH из геномной ДНК (100–500 нг на 30 мкг реакции) и кДНК (0,5–5 нг на реакцию). Праймеры для ПЦР изначально были основаны на человеческой последовательности SHH до получения видоспецифической последовательности. Все секвенирование проводили с использованием стандартной химии терминатора красителя для продуктов ПЦР. SHH последовательности человека ( Homo sapiens ; инвентарный номер GenBank), мыши ( Mus musculus ; инвентарный номер GenBank) и крысы ( Rattus norvegicus ; инвентарный номер GenBank).) были получены из баз данных NCBI. Нуклеотидные последовательности выравнивали в рамке считывания с использованием программы Megalign в пакете программ DNASTAR (DNASTAR, Мэдисон, Висконсин, США). При многовидовом выравнивании предковая последовательность была выведена с использованием экономичности. Функция Diverge из пакета Wisconsin Package v10.2 (Accelrys Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) использовалась для анализа эволюционного расхождения (т. Е. Количества синонимичных и несинонимичных замен и K a и K s оценок) по методу Ли (23).Аналогичные результаты были получены с использованием метода PAML (24). Для анализа скользящего окна K a / K s , K a был рассчитан для размера окна 90 и шага скольжения трех пар оснований, и K s из весь регион использовался в качестве знаменателя, чтобы избежать проблем, связанных со стохастической вариацией, которая иногда приводит к делению на ноль.

Статистический анализ

Для оценки статистической значимости того, что соотношение K a / K s одной линии отличается от соотношения другой линии, количество синонимичных и несинонимичных замен скорректировано на множественные совпадения и переход / трансверсию систематическая ошибка была рассчитана для обеих линий с использованием метода Ли (23), реализованного в пакете Wisconsin Package v10.2. Полученные четыре значения были помещены в таблицу сопряженности 2 × 2 и оценены на предмет статистической значимости с помощью двустороннего точного критерия Фишера.

Для оценки статистической значимости, связанной с увеличением серинов и треонинов по линии приматов, ведущей к человеку, предполагаемая последовательность SHH C для последних обезьяньих предков была сконструирована путем экономии. Затем из этой последовательности была создана таблица использования кодонов. Для каждого кодона рассчитывалась вероятность несинонимичной замены, приводящей к сериновому, треониновому или другому остатку.{13- \ pi} $$

, где P ( X S / T ) — это средняя вероятность мутации несеринового / треонинового остатка в серин или треонин, а P ( X X ) представляет собой среднюю вероятность того, что несериновый / треониновый остаток будет мутировать в другой несерин / треонин. Вероятность того, что из 13 несинонимичных изменений ни одно не выпадет на наследственный серин или треонин, но восемь или более приведут к изменению на серин или треонин, была рассчитана как произведение двух уравнений.

Прогнозирование функциональных сайтов

Вероятные сайты гликозилирования и фосфорилирования были идентифицированы механизмами онлайн-прогнозирования на http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc и http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos, соответственно, на основе нейронных сетевые алгоритмы, как описано ранее (25,26).

Анализ полиморфизма человека

Смежная двухцепочечная последовательность была получена от 42 человек (84 хромосомных копии) размером 25 т.п.н. с центром вокруг локуса SHH на хромосоме 7q36 человека.3. Эти люди были выбраны из панелей по изменчивости человека Кориелла, чтобы представить разнообразный выбор мирового населения (шесть североафриканцев, шесть южноафриканцев, шесть китайцев, шесть русских, три баска, три иберийца, три островитянина с островов Тихого океана, три выходца из Анд, три выходца из Юго-Восточной Азии и три выходца из Юго-Западной Азии). Хроматограммы последовательностей получали с помощью секвенатора ABI 3700 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) и выравнивали с помощью программного обеспечения Sequencher (Gene Codes Corporation, Анн-Арбор, Мичиган, США).Полиморфизм был обнаружен прямым анализом хроматограмм последовательностей, отображаемых Sequencher. Анализ в скользящем окне нуклеотидного разнообразия ( π ) и Tajima’s D был проведен с использованием программного обеспечения DNAsp (27) с размером окна 2500 п.н. и скользящим шагом 50 п.н. Этот размер окна был выбран для совместимости с предыдущим исследованием полиморфизма человека (16), которое использовалось в этом исследовании в качестве справочного материала. Аналогичные результаты были получены с размером окна 1000 или 2000 п.н.Анализ консервации последовательностей между человеком и мышью в скользящем окне был выполнен с помощью программного обеспечения VISTA (28) с размером окна 200 п.н. и скользящим шагом 100 п.н.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Дополнительные материалы доступны в HMG Online.

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1,.

Секвенирование генома шимпанзе: понимание эволюции человека и болезней

,

Nat.Преподобный Жене.

,

2003

, т.

4

(стр.

20

28

) 2,,.

Генетические связи между развитием мозга и эволюцией мозга

,

Nat. Преподобный Жене.

,

2005

, т.

6

(стр.

581

590

) 3,.

Передача сигналов Hedgehog в развитии животных: парадигмы и принципы

,

Genes Dev.

,

2001

, т.

15

(стр.

3059

3087

) 4,,,,,.

Автопротеолиз в биогенезе белков ежа

,

Science

,

1994

, т.

266

(стр.

1528

1537

) 5,,,,,,,,, и др.

Активность формирования паттерна Hedgehog: роль липофильной модификации, опосредованной карбоксиконцевым доменом автопроцессинга

,

Cell

,

1996

, vol.

86

(стр.

21

34

) 6,,,,,,,,, и др.

Мутационный спектр гена sonic hedgehog при голопрозэнцефалии: мутации SHH вызывают значительную долю аутосомно-доминантной голопрозэнцефалии

,

Hum.Мол. Genet.

,

1999

, т.

8

(стр.

2479

2488

) 7. ,

Molecular Evolution

,

1997

Сандерленд, Массачусетс

Sinauer Associates

8,,.

Медленные молекулярные часы у обезьян, обезьян и людей Старого Света

,

Мол. Биол. Evol.

,

2002

, т.

19

(стр.

2191

2198

) 9,,,.

Адаптивная диверсификация в большом семействе недавно дублированных, плацентарно экспрессируемых генов

,

Proc.Natl Acad. Sci. США

,

2000

, т.

97

(стр.

3319

3323

) 10,,,,,. ,

Essentials of Glycobiology

,

1999

Cold Spring Harbor, New York

Cold Spring Harbor Laboratory Press

11.,

Peptides and Protein Phosphorylation

,

1990

Boca Raton, Florida

12 CRC Press ,.

Протеолитический процессинг дает две секретируемые формы sonic hedgehog

,

Mol.Клетка. Биол.

,

1995

, т.

15

(стр.

2294

2303

) 13,.

Сигнатуры естественного отбора в геноме человека

,

Nat. Преподобный Жене.

,

2003

, т.

4

(стр.

99

111

) 14,.

Низкое нуклеотидное разнообразие у человека

,

Genetics

,

1991

, vol.

129

(стр.

513

523

) 15,,,,,,,,, и др.

Карта вариации последовательности генома человека, содержащая 1.42 миллиона однонуклеотидных полиморфизмов

,

Nature

,

2001

, vol.

409

(стр.

928

933

) 16,,,,,.

Конверсия гена и разные истории популяций могут объяснить контраст между полиморфизмом и уровнями неравновесия по сцеплению

,

Am. J. Hum. Genet.

,

2001

, т.

69

(стр.

831

843

) 17,,,,,,,,.

Вариация последовательности генома человека и влияние истории генов, мутации и рекомбинации

,

Nat.Genet.

,

2002

, т.

32

(стр.

135

142

) 18.

Статистический метод проверки гипотезы нейтральной мутации по полиморфизму ДНК

,

Genetics

,

1989

, vol.

123

(стр.

585

595

) 19,,.

Сравнительный анализ генов Shh позвоночных выявил новую консервативную некодирующую последовательность

,

Mamm. Геном

,

2003

, т.

14

(стр.

192

201

) 20,.

Доказательства роста популяции людей искажены мелкомасштабной популяционной структурой

,

Trends Genet.

,

2002

, т.

18

(стр.

559

563

) 21,,,,,,,, и др.

Важная роль Sonic hedgehog в морфогенезе волосяных фолликулов

,

Dev. Биол.

,

1999

, т.

205

(стр.

1

9

) 22,,.

Мутация белка Hox и макроэволюция тела насекомых plan

,

Nature

,

2002

, vol.

415

(стр.

914

917

) 23.

Беспристрастная оценка частоты синонимичных и несинонимичных замен

,

J. Mol. Evol.

,

1993

, т.

36

(стр.

96

99

) 24.

PAML: программный пакет для филогенетического анализа максимального правдоподобия

,

Comput. Прил. Biosci.

,

1997

, т.

13

(стр.

555

556

) 25,,,,,.

NetOglyc: прогнозирование сайтов O-гликозилирования муцинового типа на основе контекста последовательности и поверхностной доступности

,

Glycoconj.J.

,

1998

, т.

15

(стр.

115

130

) 26,,.

Прогнозирование сайтов фосфорилирования эукариотических белков на основе последовательностей и структур

,

J. Mol. Биол.

,

1999

, т.

294

(стр.

1351

1362

) 27,.

DnaSP версия 3: интегрированная программа для молекулярной популяционной генетики и анализа молекулярной эволюции

,

Bioinformatics

,

1999

, vol.

15

(стр.

174

175

) 28,,,,,,,.

VISTA: визуализация глобального выравнивания последовательностей ДНК произвольной длины

,

Bioinformatics

,

2000

, vol.

16

(стр.

1046

1047

)

© Автор, 2006. Опубликовано Oxford University Press. Все права защищены. Для получения разрешений обращайтесь по электронной почте: [email protected]

.

Sonic Hedgehog — новый канальцевый фактор роста интерстициальных фибробластов после повреждения почек

Abstract

Трубчатый эпителий составляет большую часть паренхимы почек и является основной мишенью для различных повреждений почек.Однако то, как поврежденные канальцы управляют активацией и пролиферацией интерстициальных фибробластов, остается малоизученным. Здесь мы исследовали роль sonic hedgehog (Shh), секретируемого внеклеточного сигнального белка, в пролиферации фибробластов. Shh индуцировался в эпителии почечных канальцев на животных моделях ХБП, индуцированных ишемией / реперфузионным повреждением (IRI), адриамицином или удалением почечных масс, а также в почечных канальцах биоптатов почек от пациентов с ХБП с различной этиологией. Используя репортерных мышей Gli1-CreER T2 , мы идентифицировали интерстициальные фибробласты как основные мишени передачи сигналов Shh почек in vivo . In vitro , инкубация с Shh способствовала нормальной пролиферации фибробластов почек крысы, которую оценивали с помощью подсчета клеток, анализа MTT и анализа включения BrdU, и стимулировала индукцию многочисленных генов, связанных с пролиферацией. Однако Shh не влиял на пролиферацию эпителиальных клеток почечных канальцев. In vivo сверхэкспрессия Shh способствовала размножению фибробластов и усугубляла фиброзные поражения почек после IRI. Соответственно, блокада передачи сигналов Shh циклопамином, низкомолекулярным ингибитором Smoothened, ингибировала пролиферацию фибробластов, уменьшала накопление миофибробластов и ослабляла почечный фиброз.Эти исследования идентифицируют Shh как новый, специфический и мощный фактор роста канальцев, который способствует пролиферации и активации интерстициальных фибробластов. Наши данные также предполагают, что блокада передачи сигналов Shh является вероятной стратегией терапевтического вмешательства при почечном фиброзе.

Фиброз почек, конечный общий результат широкого спектра ХЗП, характеризуется активацией продуцирующего матрикс, α -позитивного миофибробласта гладких мышц ( α -SMA), непрерывной выработкой и отложением внеклеточных матрикс и прогрессирующее образование фиброзного рубца. 1–3 Хотя миофибробласты могут происходить из разных источников, таких как костный мозг, эндотелий и канальцевый эпителий, локальная пролиферация резидентных фибробластов остается основным путем, ведущим к активации и разрастанию популяции миофибробластов в пораженных почках. 4–6 В этом контексте идентификация ключевых медиаторов, которые контролируют пролиферацию почечных фибробластов и определение основных механизмов, будет иметь важное значение для раскрытия патогенного механизма почечного фиброза и разработки рациональных стратегий вмешательства. 7

В нормальных почках взрослого человека канальцевый эпителий составляет основную часть паренхимы почек. Обширные исследования показали, что клетки канальцев особенно уязвимы для широкого спектра метаболических, иммунологических, ишемических и токсических поражений, и в большинстве случаев они являются основной мишенью для различных повреждений почек. 8–11 Эти наблюдения предполагают, что повреждение канальцев часто является ранним и центральным событием, которое запускает расширение фибробластов и интерстициальный фиброз. 10,12,13 Однако, как именно поврежденные канальцы управляют пролиферацией и активацией фибробластов в соседнем интерстиции, остается плохо изученным. Одна правдоподобная гипотеза заключается в том, что поврежденные канальцы продуцируют и секретируют внеклеточные сигнальные белки, которые паракринным образом определяют пролиферацию фибробластов. Однако идентичность такого митогенного фактора, происходящего из канальцев, для интерстициальных фибробластов остается в значительной степени неуловимой.

Sonic hedgehog (Shh), наиболее изученный член лигандов сигнального пути hedgehog, представляет собой секретируемый внеклеточный сигнальный белок, который играет фундаментальную роль в регуляции ряда процессов развития в органогенезе млекопитающих. 14,15 Во время развития почек Shh контролирует экспрессию иерархии генов, участвующих в формировании тканевого паттерна и регуляции клеточного цикла. 16–19 Соответственно, мутации в гене Shh были связаны с дефектами развития почек, что привело к гипоплазии почек у мышей. 20,21 В нормальных почках взрослого человека уровень экспрессии Shh чрезвычайно низок и практически не обнаруживается. 22 Вопрос о том, изменяется ли экспрессия Shh в пораженных почках, остается спорным.Хотя мы сообщаем, что Shh индуцируется специфически в эпителии почечных канальцев при обструктивной нефропатии после односторонней обструкции мочеточника (UUO), 22 другое исследование показывает, что он не изменяется во время UUO. 23 Тем не менее, фактор транскрипции Gli1, прямая нижестоящая мишень и репортер активной передачи сигналов hedgehog, специфически индуцируется в почечных интерстициальных фибробластах фиброзных почек. 22,23 Мы ранее предположили, что происходящий из канальцев Shh обеспечивает эпителиально-мезенхимальную коммуникацию (EMC) путем избирательного воздействия на интерстициальные фибробласты, приводя к их миофибробластическому переходу. 22 Однако остается неизвестным, действует ли Shh также как митоген и регулирует пролиферацию фибробластов, которая может приводить к увеличению популяции клеток, продуцирующих матрикс.

В этом исследовании мы исследовали регуляцию Shh на трех моделях фиброзных заболеваний почек, а также на биопсиях почек человека от пациентов с ХЗП. Наши результаты показывают, что повышающая регуляция Shh является частым явлением при CKD и что Shh избирательно способствует пролиферации фибробластов in vitro .Мы также показали, что избыточная экспрессия Shh или блокада его передачи сигналов с помощью низкомолекулярного ингибитора оказывает драматическое влияние на тяжесть почечного фиброза после повреждения почек in vivo . Эти результаты подтверждают, что происходящий из канальцев Shh является индуцибельным, специфическим и мощным митогеном фибробластов, который контролирует пролиферацию почечных фибробластов и фиброз почек.

Результаты

Тубулярная индукция Shh является частым обнаружением в различных моделях ХБП

Для изучения регуляции Shh после повреждения почек мы изучили три модели ХБП на животных, индуцированных ишемией / реперфузией почек, адриамицином (ADR) или субтотальным почечным массовая абляция.Эти модели хорошо зарекомендовали себя и широко используются, и они представляют различную этиологию, приводящую к фиброзу почек. 9,24–27 Как показано на рисунке 1A, количественный анализ RT-PCR в реальном времени (qRT-PCR) показал, что мРНК Shh почек заметно индуцировалась через 10 дней после ишемии / реперфузионного повреждения (IRI) по сравнению с фиктивным контролем. Соответственно, белок Shh также значительно индуцировался в поврежденных почках после IRI, что было показано вестерн-блоттингом лизатов цельной почки (рис. 1, B и C).Точно так же уровни мРНК Shh в почках (рис. 1E) и белка (рис. 1, F и G) были значительно повышены через 5 недель после введения ADR.

Рис. 1.

Индукция Shh — частая находка в моделях на животных с ХЗП. (A) анализы qRT-PCR показывают значительную индукцию экспрессии мРНК Shh в фиброзных почках после почечного IRI в течение 10 дней. * P <0,05 по сравнению с фиктивным контролем ( n = 4–5). (B и C) Вестерн-блоттинг почечной экспрессии белка Shh в ложных и поврежденных почках через 10 дней после IRI.Представлены репрезентативные (B) Вестерн-блоттинг и (C) количественные данные. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. * P <0,05 по сравнению с фиктивным контролем ( n = 4–5). (D) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание показывает повышенную экспрессию Shh в мышиных моделях IRI (10 дней) и нефропатии ADR (5 недель). На нижней панели увеличены заштрихованные области. Стрелки указывают на Shh-положительные канальцы. (E) Экспрессия мРНК Shh в почках при нефропатии ADR. Экспрессию мРНК Shh оценивали в почках через 5 недель после инъекции ADR.* P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 5). (F и G) Вестерн-блоттинг почечного белка Shh через 5 недель после инъекции ADR. Представлены репрезентативные (F) Вестерн-блоттинг и (G) количественные данные. Цифры (1–5) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 5). (H и I) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание показало индукцию белка Shh в модели остаточной почки крысы после нефрэктомии 5/6 через 12 недель. Масштабная линейка, 50 µ м.(J) Идентификация интерстициальных фибробластов как hedgehog-реагирующих клеток в фиброзных почках. Трансгенных мышей Gli1-CreER T2 подвергали IRI в течение 10 дней, а почки подвергали двойному иммуноокрашиванию на рекомбиназу Cre (красный) и различные маркеры, специфичные для типа клеток (зеленый). Стрелки, CD45- или CD31-положительные клетки; стрелки, Cre-позитивные клетки; широкие стрелки — клетки с положительным окрашиванием как на вементин, так и на Cre. Масштабная линейка, 20 µ м. (K) Диаграмма показывает, что Shh из канальцев специфически нацеливается на интерстициальные фибробласты после повреждения почек.GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол.

Далее мы исследовали экспрессию и локализацию белка Shh в фиброзных почках на различных моделях ХЗП. Как показано на Фигуре 1D, иммуногистохимическое окрашивание специфическим антителом показало, что в ложнооперированных контрольных почках обнаруживается небольшое количество белка Shh или его отсутствие. Однако заметная индукция белка Shh была четко очевидна в фиброзных почках после повреждения IRI или ADR. Белок Shh преимущественно локализовался в эпителии почечных канальцев (рис. 1D, стрелки), тогда как интерстициальные клетки в увеличенном интерстиции были в основном отрицательными для окрашивания Shh.Следует отметить, что окрашивание Shh не происходило в присутствии антигена Shh, что указывает на специфичность этого окрашивания (дополнительный рисунок 1). Точно так же на модели остаточной почки крысы почечный белок Shh резко индуцировался через 12 недель после нефрэктомии 5/6 по сравнению с фиктивным контролем (рис. 1, H и I). Эти результаты позволяют предположить, что индукция Shh, специфическая для канальцев, является частой находкой в ​​различных моделях ХБП на животных.

Tubule-Derived Shh нацелена на интерстициальные фибробласты

In vivo

Более ранние исследования идентифицировали почечные интерстициальные фибробласты как клетки, отвечающие за «еж» в фиброзных почках. 22,23 Для дальнейшего решения этой проблемы мы использовали трансгенных мышей Gli1-CreER T2 , у которых слитый белок Cre-ERT2, состоящий из рекомбиназы Cre и мутантного рецептора эстрогена, находится под контролем эндогенных элементов промотора / энхансера Gli1. . По существу, Cre экспрессируется исключительно в Gli1-экспрессирующих клетках, тем самым указывая на клетки-мишени передачи сигналов hedgehog у этих мышей. 28,29 Мы обнаружили, что через 10 дней после IRI Cre экспрессировался в почечных интерстициальных клетках, но не в канальцевых клетках.Двойное иммуноокрашивание показало, что Cre (рис. 1J, красный) был окрашен виментином (маркер фибробластов) (рис. 1J, зеленый), но не CD45 (общий маркер лейкоцитов) или CD31 (маркер эндотелиальных клеток) (рис. 1J). Следовательно, как показано на рисунке 1K, эти результаты предполагают, что происходящий из канальцев Shh специфически нацелен на интерстициальные фибробласты в пораженных почках.

Повышенная экспрессия Shh в почечных канальцах ХБП человека

Чтобы установить клиническую значимость регуляции Shh для патогенеза ХБП человека, мы исследовали его экспрессию в образцах биопсии почек от пациентов с различными ХБП.Как показано на рисунке 2, белок Shh практически не обнаруживается в нормальных почках человека (проверено два случая). Однако белок Shh был заметно индуцирован во всех 10 образцах биопсии от пациентов с ХБП, что было показано иммуногистохимическим окрашиванием. Диагноз и демографические данные пациентов представлены в дополнительной таблице 1. На рис. 2 представлены репрезентативные микрофотографии окрашивания Shh в срезах почек пациентов с IgA-нефропатией, мембранозным нефритом и ФСГС. Белок Shh преимущественно локализовался в эпителии почечных канальцев больных почек человека (рис. 2, стрелки).Иногда жидкости в просвете почечных канальцев также окрашиваются положительно на Shh, что позволяет предположить, что он может секретироваться канальцевыми клетками. Помимо канальцевых клеток, некоторые клубочковые подоциты также были положительными по окрашиванию Shh (данные не показаны). Однако почечные интерстициальные клетки были практически отрицательными для окрашивания Shh. Эти данные указывают на то, что Shh является индуцибельным секретируемым фактором, происходящим из канальцев, который может играть роль в патогенезе ХЗП человека.

Рисунок 2.

Shh индуцируется специфически в эпителии почечных канальцев при ХЗП человека.Образцы биопсии почек человека иммуногистохимически окрашивали специфическими антителами против белка Shh. Типичные микрофотографии показывают экспрессию и локализацию белка Shh при ХЗП человека. Неопухолевую ткань почек пациентов с почечно-клеточным раком, перенесших нефрэктомию, использовали в качестве нормального контроля. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Стрелки указывают на Shh-положительные канальцы. Масштабная линейка, 50 мкм м.

Shh избирательно способствует пролиферации почечных фибробластов

In Vitro

Поскольку интерстициальные фибробласты являются основными мишенями Shh, происходящего из канальцев, в фиброзных почках (рис. 1J), мы затем исследовали его потенциальное действие в почечных интерстициальных фибробластах in vitro .С этой целью нормальные интерстициальные фибробласты почек крысы (NRK-49F) инкубировали с различными концентрациями рекомбинантного человеческого белка Shh в течение различных периодов времени, как указано. Заметное увеличение плотности клеток NRK-49F наблюдалось после обработки Shh, что проиллюстрировано на фазово-контрастных изображениях на Фигуре 3A. Подсчет клеток показал, что Shh существенно увеличивает количество клеток NRK-49F в зависимости от дозы (рис. 3B) и времени (рис. 3C), что позволяет предположить, что Shh действует как мощный митоген, который способствует пролиферации почечных фибробластов.Аналогичные результаты были получены при использовании количественного колориметрического анализа [3-4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (рис. 3D). Мы также оценили способность Shh стимулировать почечные фибробласты, входящие в клеточный цикл и подвергающиеся синтезу ДНК, что отражалось включением бромдезоксиуридина (BrdU). Как показано на фиг. 3, E и F, повышенное включение BrdU наблюдалось в клетках NRK-49F после инкубации с Shh в течение 48 часов по сравнению с контролями. Как и ожидалось, Shh смог индуцировать свою нижестоящую цель Patched-1 (Ptch2) (рис. 3G), а также экспрессию Gli1 и α -SMA в клетках NRK-49F (данные не показаны), как сообщалось ранее. 22

Рисунок 3.

Shh избирательно способствует пролиферации клеток фибробластов in vitro . (A) Типичные микрофотографии показывают фазово-контрастные изображения почечных интерстициальных фибробластов после инкубации с рекомбинантным Shh. NRK-49F инкубировали в течение 3 дней с разными концентрациями Shh, как указано. (B и C) Shh способствует пролиферации фибробластов в зависимости от дозы и времени. Клетки NRK-49F инкубировали с (B) различными концентрациями Shh в течение 3 дней или (C) с фиксированной дозой Shh (100 нг / мл) в течение различных периодов времени, как указано.Подсчитывали и представляли количество клеток (× 1000 на лунку). * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 3). (D) Графическое представление показывает, что Shh способствует пролиферации клеток NRK-49F, оцененной с помощью колориметрического анализа МТТ. * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 3). (E) Типичные микрофотографии показывают, что Shh способствует синтезу ДНК фибробластов, что показано включением BrdU. Клетки NRK-49F инкубировали с 50 и 100 нг / мл Shh в течение 2 дней. Клетки иммуноокрашивали мышиным антителом против BrdU (красный).SYTO-Green (зеленый) использовался для визуализации ядер. Стрелки указывают на BrdU-положительные клетки. (F) Количественное определение процента BrdU-положительных клеток после обработки Shh. * P <0,05 по сравнению с контролем ( n = 3). (G) Ptch2 экспрессируется в почечных фибробластах и ​​индуцируется Shh. Клетки NRK-49 F обрабатывали различными концентрациями Shh в течение 24 часов или 50 нг / мл Shh в течение различных периодов времени, как указано. (H – J) Shh не способствует пролиферации клеток проксимальных канальцев почек.Клетки HKC-8 инкубировали с (H) 100 нг / мл Shh в течение различных периодов времени или (I и J) с разными концентрациями Shh в течение 3 дней. Клеточную пролиферацию оценивали с помощью (H и I) подсчета количества клеток или (J) колориметрического анализа МТТ. (K) Вестерн-блоттинг показывает, что Shh способствует экспрессии множества генов, связанных с пролиферацией, в фибробластах. Клетки NRK-49F инкубировали с Shh (50 нг / мл) в течение различных периодов времени, как указано. Лизаты клеток подвергали Вестерн-блоттингу на c-myc, c-fos, PCNA и актин.

Мы также исследовали, влияет ли Shh на пролиферацию эпителиальных клеток почечных канальцев, в которых Shh активируется (рис. 1 и 2). С этой целью клетки проксимальных канальцев человека (HKC-8) и клетки внутреннего мозгового собирательного протока мыши (mIMCD-3) инкубировали с различными дозами Shh в течение различной продолжительности. Как показано на фиг. 3, H – J, Shh не оказывала влияния на пролиферацию клеток HKC-8. Точно так же Shh также не способствует пролиферации клеток mIMCD-3 (дополнительный рисунок 2). Фактически, он проявлял небольшое, но значительное ингибирование клеток mIMCD-3, как оценивалось с помощью анализа МТТ (дополнительная фигура 2C).Следовательно, ясно, что происходящий из канальцев Shh избирательно нацелен на интерстициальные фибробласты, но не на эпителиальные клетки канальцев, и способствует пролиферации фибробластов в качестве мощного митогена.

Shh активирует гены, связанные с пролиферацией в фибробластах

Чтобы очертить механизм, лежащий в основе Shh-опосредованной пролиферации фибробластов, мы затем исследовали экспрессию многочисленных генов, связанных с пролиферацией, в клетках NRK-49F. Как показано на фиг. 3K, как c-Myc, так и ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) быстро индуцировались Shh в клетках NRK-49F уже при 0.Через 5 часов после обработки. Хотя индукция c-Myc была временной, повышающая регуляция PCNA поддерживалась на протяжении всех экспериментов. Экспрессия c-fos, основного компонента факторов транскрипции AP-1, также индуцировалась Shh в зависимости от времени (рис. 3K). Эти результаты предполагают, что Shh может быстро активировать несколько генов, связанных с пролиферацией, в интерстициальных фибробластах почек, что приводит к усилению пролиферации клеток.

Сверхэкспрессия Shh

In vivo ускоряет AKI до прогрессирования ХБП

Учитывая способность Shh способствовать пролиферации фибробластов in vitro , мы стремились изучить, влияет ли избыточная экспрессия экзогенного Shh in vivo на пролиферацию фибробластов и прогрессирование почек фиброз после ОПП.С этой целью мы использовали мышиную модель IRI, в которой в тканях почек развиваются фиброзные поражения в поздние сроки после ишемической AKI. 9,26 Как показано на рисунке 4A, вектор экспрессии Shh (pFlag-Shh) или пустой контрольный вектор (pcDNA3) вводили через 3 дня после IRI с помощью метода переноса генов на основе гидродинамики, подхода, который приводит к значительной экспрессии в почках. трансгена. 30,31 Анализы ОТ-ПЦР показали, что мРНК для Shh и его нижележащего гена-мишени Gli1 индуцировалась через 7 дней после однократной инъекции Shh-экспрессирующей плазмиды (через 10 дней после IRI) (фиг. 4B).Также индуцировался белок Shh, о чем свидетельствовал вестерн-блот-анализ лизатов цельной почки с использованием антител против Shh или против Flag (Фиг.4, C и D). Иммуногистохимическое окрашивание показало, что белок Shh преимущественно индуцировался в эпителии почечных канальцев после инъекции плазмиды (рис. 4E). Точно так же почечная экспрессия эндогенного белка Gli1 также индуцировалась после сверхэкспрессии экзогенного Shh (рис. 4F). Следовательно, доставка генов на основе гидродинамики приводит к сверхэкспрессии Shh в эпителии почечных канальцев in vivo после IRI.

Рисунок 4.

Shh экспрессируется в эпителии почечных канальцев in vivo после гидродинамического переноса гена. (A) Экспериментальный дизайн. Красные стрелки указывают момент почечного IRI. Белые и красные стрелки указывают моменты времени, когда вводили pcDNA3 или pFlag-Shh соответственно. (B) ОТ-ПЦР показывает экспрессию мРНК Shh и Gli1 в почках через 7 дней после инъекции одной плазмиды. (C и D) Вестерн-блоттинг экспрессии почечного белка Shh через 7 дней после инъекции плазмиды.Лизаты почек подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против Shh, Flag или α -тубулина. Представлены репрезентативные (C) Вестерн-блоттинг и (D) количественные данные. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3. Цифры (1–4) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (E) Типичные микрофотографии показывают экспрессию и локализацию почечного белка Shh через 7 дней после инъекции плазмиды. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Масштабная линейка, 50 мкм м. (F) Репрезентативные вестерн-блоты показывают экспрессию почечного белка Gli1 через 7 дней после инъекции плазмиды.

Мы обнаружили, что избыточная экспрессия Shh in vivo способствует пролиферации интерстициальных клеток почек и ускоряет прогрессирование почечного фиброза. Как показано на фиг. 5, A и B, экзогенный Shh стимулировал исключительно пролиферацию клеток в интерстициальном компартменте почек, но не в сегментах канальцев, что было проиллюстрировано иммуногистохимическим окрашиванием Ki67-положительных клеток. Это увеличение пролиферации интерстициальных клеток почек тесно коррелировало с повышенной экспрессией мРНК генов интерстициального матрикса, таких как коллагены типов I и III (рис. 5, C и D).Соответственно, уровни почечного белка рецептора тромбоцитарного фактора роста β (PDGFR- β ), десмина и α -SMA, характерных маркеров активных миофибробластов, 1,3 также были заметно индуцированы (рис. 5E). Между тем, сверхэкспрессия Shh ускоряет накопление и отложение основных белков интерстициального матрикса, таких как фибронектин, в поврежденных почках (рис. 5E), что было показано вестерн-блоттингом лизатов цельной почки. Соответственно, окрашивание трихромом по Массону (MTS) показало, что экзогенный Shh in vivo усугубляет фиброзные поражения почек после IRI (рис. 5, H и I).

Рисунок 5.

Сверхэкспрессия экзогенного Shh in vivo способствует пролиферации интерстициальных клеток и ускоряет прогрессирование почечного фиброза после AKI. (A) Типичные микрофотографии показывают иммуногистохимическое окрашивание на Ki67 через 7 дней после инъекции плазмиды. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Желтые стрелки указывают на Ki67-положительные клетки. Масштабная линейка, 50 мкм м. (B) Количественное определение Ki67-положительных клеток в почечных канальцах и интерстициальных компартментах.* P <0,05 по сравнению с pcDNA3. HPF, поле большой мощности. (C и D) анализы qRT-PCR показывают, что сверхэкспрессия Shh in vivo способствовала экспрессии в почках (C) коллагена I и (D) коллагена III после IRI. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3 ( n = 4–6). (E) Вестерн-блоттинг экспрессии в почках различных генов, связанных с фиброзом. Лизаты почек подвергали иммуноблоттингу со специфическими антителами против PCNA, PDGFR- β , десмина, фибронектина, α -SMA и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).Цифры (1–4) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (F и G) Графическое представление уровней почечного белка различных генов, связанных с фиброзом. Данные представлены в виде кратной индукции по сравнению с контролями pcDNA3. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3; ** P <0,01 по сравнению с pcDNA3. (H) Типичные микрофотографии показывают отложение коллагена в почках через 7 дней после инъекции плазмиды. Парафиновые срезы подвергали МТС. Области, выделенные рамкой, увеличены на правых панелях. Стрелки указывают на область депонирования коллагена с синим окрашиванием.Масштабная линейка 150 мкм м. (I) Графическое представление показывает фиброзные поражения почек через 7 дней после инъекции плазмиды после количественного определения. * P <0,05 по сравнению с pcDNA3.

Блокада передачи сигналов Shh снижает фиброз почек

Далее мы исследовали, может ли блокада передачи сигналов Shh подавлять пролиферацию фибробластов и уменьшать фиброз почек. С этой целью мы оценили терапевтическую эффективность циклопамина (CPN), низкомолекулярного ингибитора Smoothened (Smo), 22,32 при установленном повреждении почек, вызванном IRI.Как показано на фиг. 6A, CPN вводили путем ежедневных внутрибрюшинных инъекций, начиная с 3 дней после IRI, момента времени, когда функция почек начинает восстанавливаться после AKI. 33 Как показано на Фигуре 6B, почечная экспрессия мРНК Gli1, прямой нижестоящей мишени и репортерного гена передачи сигналов hedgehog, была существенно подавлена ​​через 7 дней после введения CPN (10 дней после IRI) in vivo . Точно так же экспрессия почечного белка Gli1 также снижалась после обработки CPN (фиг. 6C).Эти данные указывают на то, что CPN эффективен в блокировании передачи сигнала Shh in vivo . Однако не наблюдалось значительных изменений в экспрессии мРНК Gli2 и Gli3 в почках (дополнительный рисунок 3).

Рисунок 6.

Блокада передачи сигналов Shh снижает фиброз почек после IRI. (A) Экспериментальный дизайн. Зеленые стрелки указывают на инъекцию CPN, тогда как белые стрелки указывают на инъекцию носителя. (B) анализы qRT-PCR показывают, что CPN ингибирует экспрессию мРНК Gli1 в почках. * P <0.05 по сравнению с фиктивным контролем; P <0,05 по сравнению с автомобилями ( n = 3). (C) Репрезентативные вестерн-блоты показывают экспрессию почечного белка Gli1 в различных группах, как указано. Лизаты почек иммуноблотировали с антителами против Gli1 и актина. Veh, автомобиль. (D) Репрезентативные микрофотографии показывают, что CPN улучшает фиброзные поражения почек после IRI. Срезы почек подвергали МТС. Области, выделенные рамкой, увеличены и представлены на нижних панелях. Стрелками обозначены фиброзные участки с синим окрашиванием.Масштабная линейка, 50 мкм м. (E) Количественное определение фиброзных поражений почек в разных группах. Фиброзные поражения почек (определяемые как процент MTS-положительной фиброзной области) количественно оценивали с помощью компьютерного морфометрического анализа. P <0,05 по сравнению с автомобилями. (F – I) анализы qRT-PCR показывают, что CPN ингибирует почечную экспрессию (F) коллагена I, (G) коллагена III, (H) фибронектина и (I) α -SMA после IRI. * P <0,05 по сравнению с фиктивными контролями; P <0.05 по сравнению с транспортными средствами ( n = 3–5).

Мы дополнительно оценили тяжесть почечного фиброза на этой модели после инъекций CPN. Как представлено на фиг. 6, D и E, MTS выявила меньшее количество фиброзных повреждений и снижение отложения коллагена в почках, получавших CPN, по сравнению с контрольными носителями. Соответственно, почечная экспрессия основных генов интерстициального матрикса, таких как коллагены I и III типов и фибронектин, заметно снижалась после введения CPN (рис. 6, F – H). Экспрессия α -SMA, маркера-сигнатуры активных миофибробластов, также ингибировалась обработкой CPN (фиг. 6I).Эти данные показывают, что блокирование передачи сигналов Shh способно улучшить повреждение почек и предотвратить прогрессирование почечного фиброза после IRI.

Блокада передачи сигналов Shh избирательно ингибирует пролиферацию почечных фибробластов

In vivo

Чтобы изучить механизм, лежащий в основе положительного эффекта CPN, мы исследовали его роль в модулировании пролиферации и увеличения почечных фибробластов in vivo . Как показано на фиг. 7, A и B, экспрессия белка PCNA значительно ингибировалась CPN в фиброзных почках через 10 дней после IRI по сравнению с контрольными носителями.Чтобы определить источники пролиферирующих клеток почек, мы провели двойное иммуноокрашивание на Ki67 (рис. 7C, красный) и ламинин (рис. 7C, зеленый), главный компонент базальной мембраны канальцев. Как показано на Фигуре 7C стрелками, большинство Ki67-положительных клеток было локализовано в интерстициальном компартменте, что указывает на преимущественное увеличение популяции интерстициальных клеток в этот момент времени (10 дней) после IRI. Интересно, что CPN избирательно ингибировал пролиферацию интерстициальных клеток (фигура 7D), но не влиял на пролиферацию канальцевых клеток (фигура 7E).

Рисунок 7.

Блокада передачи сигналов Shh избирательно подавляет пролиферацию интерстициальных фибробластов почек. (A и B) Вестерн-блоттинг показывает, что CPN ингибирует экспрессию PCNA в почках через 10 дней после IRI. Представлены репрезентативные (A) Вестерн-блоттинг и (B) количественные данные. * P <0,05 по сравнению с транспортным средством. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. (C) Типичные микрофотографии показывают, что CPN ингибирует пролиферацию интерстициальных клеток почек после IRI. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на Ki67 (красный) и ламинин (зеленый) показывает, что Ki67-положительные клетки преимущественно локализовались в интерстициальном компартменте.Области, выделенные рамкой, увеличены и представлены на правых панелях. Стрелки указывают на Ki67-положительные клетки в интерстиции, тогда как стрелки обозначают тубулярные клетки с Ki67-положительным окрашиванием. Масштабная линейка, 50 мкм м. (D и E) CPN избирательно ингибирует пролиферацию интерстициальных, но не канальцевых клеток in vivo после IRI. Приведены количественные данные о Ki67-положительных клетках в интерстициальном (D) и канальцевом (E) компартментах. * P <0,05 по сравнению с транспортным средством. (F и G) Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание показывает определение Ki67 (красный) и различных клеточных маркеров (зеленый) в почках через 10 дней после IRI.Используемые маркеры, специфичные для определенного типа клеток, включают CD31 (эндотелиальные клетки), CD45 (лейкоциты) и α -SMA (миофибробласты). Количественные данные о стоимости для Ki67 и различных маркеров, специфичных для типов клеток, представлены в G. DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол. (H – J) Вестерн-блоттинг почечного PDGFR- β , десмина, фибронектина. и экспрессия α -SMA через 10 дней после IRI. Представлены репрезентативные (H) Вестерн-блоттинг и (I и J) количественные данные. * P <0.05 по сравнению с автомобилем. Цифры (1–3) обозначают каждое отдельное животное в данной группе. Fn, фибронектин. (K) Типичные микрофотографии иммуногистохимического окрашивания показывают, что CPN ингибирует экспрессию PDGFR- β в почках и экспрессию десмина после IRI. Стрелки указывают положительные клетки. Масштабная линейка, 50 мкм м. HPF, поле большой мощности.

Для дальнейшего выяснения идентичности этих пролиферирующих интерстициальных клеток мы выполнили дополнительное определение стоимости для Ki67 (рис. 7F, красный) и различных маркеров, специфичных для типа клеток (рис. 7F, зеленый).Как показано на Фигуре 7F, не было определения стоимости Ki67 и CD31, специфического маркера эндотелиальных клеток. Точно так же наблюдалась небольшая стоимость Ki67 и CD45, общего лейкоцитарного маркера. Однако Ki67 в значительной степени был локализован с α -SMA, маркером миофибробластов (фигура 7F, стрелки). Количественное определение показало, что более 80% Ki67-положительных клеток были α -SMA-положительными миофибробластами в пораженных почках после IRI (рис. 7G), что свидетельствует о преимущественной пролиферации фибробластов через 10 дней после IRI.Следовательно, CPN в значительной степени нацелился на фибробласты и избирательно предотвращал их пролиферацию и рост.

В соответствии со сниженной пролиферацией фибробластов обработка CPN также ингибировала экспрессию PDGFR- β и десмина, двух сигнатурных белков, которые определяют активацию фибробластов. Как проиллюстрировано анализами вестерн-блоттинга, почечный PDGFR- β и десмин были значительно снижены после инъекции CPN по сравнению с контрольными носителями (фиг. 7, H и I). Иммуногистохимическое окрашивание также выявило заметное подавление экспрессии PDGFR- β и десмина с помощью CPN (фиг. 7K).Соответственно, CPN также значительно ингибировал почечную экспрессию α -SMA и белков фибронектина (фиг. 7, H и J). Эти результаты показывают, что блокада передачи сигналов Shh с помощью CPN снижает фиброз почек за счет избирательного ингибирования пролиферации и активации фибробластов в пораженных почках.

Обсуждение

Пролиферация и активация интерстициальных фибробластов являются основными и частыми патологическими признаками ХЗП, которые в конечном итоге приводят к увеличению популяции продуцирующих матрикс клеток в пораженных почках.Однако идентичность и источники внеклеточных сигналов, контролирующих пролиферацию фибробластов, остались плохо изученными. Результаты, представленные в этом исследовании, показывают, что происходящий из канальцев Shh является новым, индуцибельным и мощным митогеном, который специфически способствует пролиферации фибробластов в соседнем интерстиции. Этот вывод подтверждается несколькими линиями in vitro и in vivo доказательства. Наши данные иллюстрируют решающую роль Shh в регуляции разрастания фибробластов и фиброза почек после повреждения почек, прежде всего через посредничество EMC.

Shh является прототипом трех лигандов в сигнальной системе hedgehog. Это секретируемый белок, модифицированный холестерином и пальмитоилом, и он функционирует как классический морфоген, вещество, регулирующее формирование тканевого паттерна во время развития млекопитающих. 34,35 Shh проявляет свое действие посредством связывания с рецептором плазматической мембраны Ptch2, что ведет к интернализации и деградации Ptch2, приводя к дерепрессии семимембранного G-белка-связанного с рецептором подобного рецептору. 17,36 В нормальных почках взрослого человека ген Shh находится в относительно спокойном состоянии, и его экспрессия практически не обнаруживается у мышей, крыс и людей (Рисунки 1 и 2).Однако экспрессия Shh явно индуцируется преимущественно в эпителии почечных канальцев после повреждения почек. Следует отметить, что, хотя мы ранее показали индукцию Shh в UUO мыши, 22 , другой отчет указывает, что она не изменилась в той же модели. 23 Точная причина такого несоответствия остается неизвестной, но это может быть связано с конкретной используемой методологией. Fabian et al. 23 оценивали экспрессию Shh только с помощью ОТ-ПЦР, подхода, который подвержен вариациям специфичности праймеров и условий эксперимента.Напротив, наши результаты по индукции Shh после UUO были показаны с помощью комбинации RT-PCR, вестерн-блоттинга и иммуногистохимического окрашивания. 22 Используя три дополнительных модели почечного фиброзного заболевания, мы теперь подтвердили, что Shh индуцируется в пораженных почках после IRI, ADR и удаления почечных опухолей (Рисунок 1). Кроме того, Shh также индуцируется в биоптатах почек человека от пациентов с различными заболеваниями почек с различной этиологией (рис. 2), что свидетельствует о клинической значимости индукции Shh для возникновения и прогрессирования заболеваний почек человека.Взятые вместе, наши данные показывают, что экспрессия Shh индуцируется во всех четырех моделях животных (UUO, IRI, ADR-нефропатия и остаточная почка после нефрэктомии 5/6), протестированных и с ХЗП человека, что указывает на то, что индукция Shh является универсальным и частым явлением в патогенез широкого спектра ХБП.

Хотя Shh преимущественно индуцируется в эпителии почечных канальцев пораженных почек, он избирательно нацеливается и специфически способствует пролиферации интерстициальных фибробластов (Рисунки 1 и 3). Это открытие согласуется с более ранними сообщениями об использовании Gli1 LacZ мышей, у которых почечный Gli1 избирательно индуцируется в активных фибробластах в интерстициальном компартменте после UUO. 22,23 В этом исследовании мы повторно рассмотрели этот вопрос с использованием мышей Gli-CreER T2 и показали, что Cre, управляемый Gli1, специфически экспрессируется в виментин-позитивных фибробластах, но не в CD45-позитивных лейкоцитах и ​​CD31-позитивных эндотелиальных клетках. клетки (рисунок 1) после IRI. Таким образом, используя две модели (UUO и IRI) и разных репортерных мышей (Gli1 LacZ и Gli-CreER T2 ), мы четко установили, что Shh, происходящий из канальцев, избирательно нацеливается на интерстициальные фибробласты, что приводит к их пролиферации и активации. 22 Способность Shh стимулировать пролиферацию фибробластов весьма впечатляюща, о чем судили по подсчету клеток, анализу МТТ и оценке включения BrdU (рис. 3), предполагая, что Shh, полученный из канальцев, может быть долгожданным мощным митогеном, который контролирует разрастание и разрастание фибробластов в прилегающем интерстиции. Хотя это не было проверено, существует вероятность того, что Shh также может влиять на выживаемость фибробластов. Идентификация Shh как фактора роста фибробластов также согласуется с появляющимися доказательствами того, что повреждение канальцев является ранним и основным событием в почечном фиброгенезе. 9,10 Таким образом, наши исследования установили, что Shh, растворимый фактор, происходящий из поврежденных канальцев, играет решающую роль в определении размера популяции фибробластов в пораженных почках, прежде всего, опосредуя EMC.

Процесс перехода фибробластов в миофибробласты во время почечного фиброза проявляется усилением пролиферации клеток, de novo экспрессией α -SMA, усилением продукции интерстициального матрикса и потерей способности продуцировать эритропоэтин. 1,4,37 Похоже, что Shh является полным фиброгенным митогеном, который не только способствует пролиферации фибробластов, но также индуцирует их миофибробластический переход, поскольку Shh способен индуцировать α -SMA, коллаген I, фибронектин и экспрессию десмина в культивированные фибробласты, как сообщалось ранее. 22 Эти комбинированные эффекты Shh на пролиферацию фибробластов и фенотипический переход могут привести к резкому увеличению популяции продуцирующих матрикс клеток в пораженных почках.Однако, происходит ли Shh-индуцированная пролиферация фибробластов и их миофибробластическая активация параллельно или последовательно, еще предстоит определить. Более того, также неясно, опосредуются ли пролиферация фибробластов и фенотипический переход, контролируемые Shh, общими или отдельными внутриклеточными сигнальными путями.

Наиболее интересным открытием этого исследования является подтверждение решающей роли Shh в обеспечении пролиферации фибробластов и фиброза почек in vivo .Используя подход, основанный на усилении или потере функции, мы показываем, что Shh способствует фиброзу почек во время перехода от ОПН к ХБП после травмы, и эта проблема все чаще признается в клинических исследованиях. 38–40 В соответствии с данными in vitro , сверхэкспрессия Shh с помощью подхода доставки генов, основанного на гидродинамике, приводит к значительной экспрессии функционального Shh, что было показано с помощью индукции мРНК и белка Gli1 в почках (рис. 4), и заметно ускоряет прогрессирование фиброзных поражений почек (рис. 5).Мы решили манипулировать экспрессией Shh через 3 дня после IRI, потому что к этому моменту острая фаза повреждения и восстановления почек в этой модели почти завершена, о чем судят по уровню креатинина в сыворотке. 9,33 Соответственно, ингибирование передачи сигналов Shh ингибитором Smo CPN также избирательно блокирует пролиферацию интерстициальных фибробластов и уменьшает фиброз почек (Фигуры 6 и 7). Эти результаты однозначно показывают фундаментальную роль передачи сигналов Shh в контроле пролиферации фибробластов и почечного фиброза in vivo и предполагают, что блокада передачи сигналов Shh с помощью низкомолекулярного ингибитора может быть правдоподобной стратегией терапевтического вмешательства при ХБП.

Таким образом, используя несколько моделей на животных и биопсии почек человека, мы показали, что индукция Shh по канальцам является частым патологическим признаком при большом разнообразии ХБП. Эти исследования также идентифицируют Shh как новый, специфический и мощный митоген, который избирательно способствует пролиферации фибробластов in vitro и in vivo . Следовательно, Shh может быть долгожданным фибробласт-специфическим фактором роста из канальцев в поврежденных почках. Наши результаты также подтверждают принцип, согласно которому блокада передачи сигналов Shh может быть новой стратегией терапевтического лечения почечного фиброза при ХБП.

Краткие методы

Модели на животных

Самцов мышей BALB / c массой около 20-25 г были получены от Harlan Sprague – Dawley. Почечный IRI был выполнен на мышах BALB / c с использованием установленного протокола, как описано в другом месте. 41 Вкратце, двусторонние почечные ножки зажимали в течение 35 минут с помощью зажимов для микроаневризмы. Во время ишемического периода температура тела поддерживалась между 35 ° C и 37,5 ° C с помощью системы нагрева с регулируемой температурой. Через 3 дня после IRI мышей подвергали либо однократной внутривенной инъекции плазмиды экспрессии Shh (фиг. 4A), либо ежедневным внутрибрюшинным инъекциям CPN (Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури) в дозе 5 мг / кг массы тела в течение 7 дней (Фигура 6А), как сообщалось ранее. 22,31 Мышей умерщвляли через 10 дней после IRI, и ткани почек собирали для различных анализов. Для модели нефропатии ADR самцам мышей BALB / c вводили ADR (гидрохлорид доксорубицина; Sigma-Aldrich) путем однократной внутривенной инъекции в дозе 10 мг / кг массы тела, как сообщалось ранее. 24 Мышей умерщвляли через 5 недель после инъекции ADR. Кроме того, модель остаточной почки была создана у самцов крыс Sprague-Dawley путем нефрэктомии 5/6, как описано в другом месте. 25 Почки собирали через 12 недель и подвергали различным анализам.

В отдельных экспериментах трансгенные мыши Gli1-CreER T2 , у которых рекомбиназа Cre находится под контролем эндогенных элементов промотора / энхансера Gli1, были получены из лаборатории Джексона (запас № 007913). 42 Мышам внутрибрюшинно вводили тамоксифен (T5648; Sigma-Aldrich) в дозе 25 мг / кг веса тела в течение 5 дней, а затем подвергали IRI, как описано выше. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных в Университете Питтсбурга.

Конструирование вектора экспрессии Shh и

In vivo перенос гена

Плазмидный вектор, содержащий кДНК Shh человека, был получен от Addgene (pBS-hShh, # 13996). Вставку кДНК Shh высвобождали и субклонировали в вектор экспрессии млекопитающих p3xFlag (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния), используя рутинную методику молекулярного клонирования. Пустой вектор экспрессии pcDNA3 был приобретен у Invitrogen. Плазмидную ДНК вводили мышам с помощью метода переноса генов, основанного на гидродинамике, путем быстрой инъекции большого объема раствора ДНК через хвостовую вену, как описано в другом месте. 30 Вкратце, 20 мкл г плазмидной ДНК разводили в 1,8 мл физиологического раствора и вводили через хвостовую вену в кровоток мыши в течение 5-10 секунд. Мышам контрольной группы аналогичным образом инъецировали 20 мкг г пустого вектора pcDNA3. Плазмиды вводили через 3 дня после IRI, мышей умерщвляли через 10 дней (фиг. 4A) и собирали образцы ткани почек.

Образцы биопсии почек человека

Образцы почек человека были получены из диагностических биопсий почек, выполненных в больнице Наньфанг Южного медицинского университета.Неопухолевую ткань почек пациентов с почечно-клеточным раком, перенесших нефрэктомию, использовали в качестве нормального контроля. Залитые в парафин биопсийные срезы почек человека (2,5- мкм толщиной мкм) получали с использованием стандартной процедуры. Все исследования с участием срезов почек человека были одобрены институциональным наблюдательным советом Питтсбургского университета и институциональным этическим комитетом Южного медицинского университета.

Клеточная культура

Клетки NRK-49F и mIMCD-3 были получены из Американской коллекции типовых культур.HKC-8 был предоставлен Л. Ракузеном (Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд). Клетки поддерживали, как описано ранее. 22 Клетки NRK-49F, HKC-8 и mIMCD-3, лишенные сыворотки, обрабатывали рекомбинантным человеческим белком Shh (StemRD Inc., Burlingame, CA) в различных концентрациях в течение различных периодов времени, как указано. Затем клетки собирали и подвергали различным анализам.

Анализ пролиферации клеток

Пролиферацию клеток оценивали двумя подходами: подсчетом клеток и анализом МТТ.Количество клеток подсчитывали с помощью гемацитометра. Клеточную пролиферацию также определяли количественно с помощью МТТ-анализа. Вкратце, клетки NRK-49F, HKC-8 и mIMCD-3 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2 × 10 3 / лунку. После прикрепления клеток культуры заменяли бессывороточной средой и инкубировали в течение 24 часов с последующей обработкой Shh или без Shh в различных концентрациях в течение различных периодов времени, как указано. МТТ (5 мг / мл) добавляли к среде в количестве 10 мкл мкл / лунку с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 4 часов.После удаления среды клетки лизировали 100 мкл мкл диметилсульфоксида. Поглощение каждой лунки измеряли считывателем микропланшетов при длине волны 490 нм.

Анализ включения BrdU

Влияние Shh на синтез ДНК фибробластов оценивали по включению BrdU. Вкратце, клетки высевали на 24-луночные планшеты и обрабатывали различными концентрациями Shh в течение 48 часов, а затем им пульсировали BrdU (10 мкМ М) в течение 24 часов. Клетки фиксировали ледяным 70% этанолом в течение 20 минут, и ДНК денатурировали путем инкубации с 2.5 н. HCl в течение 20 минут с последующей нейтрализацией 0,1 М борной кислотой. Активность эндогенной пероксидазы гасили инкубацией клетки с 3% H 2 O 2 в PBS в течение 20 минут, а неспецифическое связывание блокировали путем инкубации клеток с 10% ослиной сывороткой в ​​течение 10 минут при комнатной температуре, как описано ранее. 7 Инкорпорированный BrdU детектировали с помощью мышиного моноклонального антитела против BrdU (B2531; Sigma-Aldrich) с последующей инкубацией с конъюгированным с цианином Cy3, аффинно очищенным вторичным антителом (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA).Окрашенные клетки помещали в среду для закрепления противоэпидемических элементов Vectashield, используя SYTO-Green для визуализации ядер. Окрашенные образцы просматривали под эпифлуоресцентным микроскопом Eclipse E600, оборудованным цифровой камерой (Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк).

qRT-PCR в реальном времени

Полную РНК экстрагировали с использованием системы выделения РНК TRIzol (Invitrogen). Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора для системы обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя (Promega, Madison, WI).qRT-PCR выполняли в системе определения последовательности ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), как описано ранее. 22 Последовательности пар праймеров для различных генов показаны в дополнительной таблице 2. ПЦР проводили в стандартных условиях. Уровни мРНК различных генов рассчитывали после нормализации с помощью β-актина.

Вестерн-блот-анализ

Ткани почек лизировали буфером для анализа радиоиммунопреципитации, содержащим 1% NP-40, 0,01 тергитол-типа.1% SDS, 100 мкл г / мл PMSF, 1% коктейль ингибиторов протеазы и 1% коктейль ингибиторов фосфатазы I и II (Sigma-Aldrich) в PBS на льду. Супернатанты собирали после центрифугирования при 13000 × g при 4 ° C в течение 15 минут. Экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга, как описано ранее. 43 В качестве первичных используемых антител были анти-Shh (sc-9024), анти-PDGFR- β (sc-432), анти-PCNA (sc-56) и анти-c-Myc (sc-40s). от Santa Cruz Biotechnology, анти-Gli1 (AF3455) от R&D Systems, антифибронектин (F3648), анти– α -SMA (A2547), антидесмин (D1033), анти-Flag (F4042) и анти– α -тубулин (T9026) от Sigma-Aldrich, анти-c-fos (PC05) от Calbiochem, анти-актин (MAB1501) от Chemicon и анти-GAPDH (# 2118s) от Cell Signaling Technology.

Гистология и иммуногистохимическое окрашивание

Залитые парафином срезы почек мыши (3- мкм толщиной мкм) получали обычным способом. Срезы окрашивали реагентами MTS по стандартному протоколу. Иммуногистохимическое окрашивание проводили согласно установленному протоколу, как описано ранее. 41 Антитела против Shh (sc-9024; Santa Cruz Biotechnology), PDGFR- β (sc432; Santa Cruz Biotechnology), десмина (D1033; Sigma-Aldrich) и Ki67 (ab66155; Abcam, Inc.) были использованы.

Коиммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия

Криосрезы почек фиксировали 3,7% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре и погружали в 0,2% Triton X-100 на 10 минут. После блокирования 10% ослиной сывороткой в ​​PBS в течение 1 часа слайды были коиммуноокрашены следующими антителами: анти-Cre (MAB3120; EMD Millipore), анти-Ki67 (ab66155; Abcam, Inc.), анти-ламинин (L8271; Sigma). -Aldrich), анти- α -SMA (A2547; Sigma-Aldrich), анти-CD45 (ab60291; Abcam, Inc.) и анти-CD31 (550274; BD Pharmingen). Для визуализации первичных антител слайды окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с цианином Cy2 или Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Окрашенные слайды просматривали под конфокальным микроскопом Leica TCS-SL, оснащенным цифровой камерой.

Статистический анализ

Все данные были выражены как средние значения ± SEM. Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения SigmaStat (Jandel Scientific Software, Сан-Рафаэль, Калифорния). Сравнения между группами проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Ньюмана-Кеулса. P <0,05 считалось значимым.

Выражение признательности

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения DK064005 и DK0, грантом Национальной программы 973 ​​2012CB517700 и Национальным научным фондом Китая грантами 81130011 и 81370839. RJT был поддержан Национальными институтами здравоохранения и докторской стипендией K06-DK06-DK06-DK06. Переходный грант Американской кардиологической ассоциации 13FTF169.

  • Авторские права © 2014 Американского общества нефрологов

Критические роли ARHGAP36 как медиатора передачи сигнала пути Shh в спецификации боковых столбчатых двигателей

[…] Решение этих различных проблем потребует новых экспериментов, которые, вероятно, займут значительно больше времени, чем обычно выделяются два месяца на редактирование рукописей eLife.Поэтому мы с сожалением решили отклонить вашу рукопись.

Одна из основных проблем рецензентов заключалась в том, могла ли делеция Shh в эмбрионах мышей с использованием линии делетеров Olig2-Cre исключить дефекты формирования паттерна или пролиферации из-за элиминации Shh в вентральных предшественниках, а не в постмитотических нейронах. Автор обзора указал, что «поскольку Olig2 изначально экспрессируется в самом вентральном домене спинного мозга, за исключением наиболее медиальных клеток [1], нельзя исключить, что Shh был удален Olig2-Cre из клеток в раннем Olig2. + предшественник домена, что приводит к наблюдаемому фенотипу.«

Мы понимаем, почему рецензент выразил озабоченность тем, что Shh, секретируемый из пластинки пола, имеет решающее значение для формирования паттерна вентральной нервной трубки, влияя, таким образом, на последующую дифференцировку мотонейронов. Однако данные моей лаборатории и других групп показывают, что экспрессия Shh в пластине пола не нарушена в нашей модели мыши Shh-cKO; Olig2-Cre, исключая возможность того, что наблюдаемый фенотип вызван делецией Shh в полу. тарелка.

Во-первых, важно отметить, что Shh специфически экспрессируется в пластинке дна, но не в нейронах, на ранней стадии развития спинного мозга, когда вентральные предшественники подвергаются Shh-зависимому формированию паттерна.Наши данные гибридизации in situ (рис. 1A, B) согласуются с предыдущими отчетами. Кроме того, подтверждая характерный для донной пластинки паттерн экспрессии Shh, активность Shh-Cre также обнаруживается исключительно в донной пластине [2] (см. Рисунок 1N ‘, N «из Varadarajan et al., 2017 Neuron [3]).

Во-вторых, Olig2-Cre не активен в плите пола. Например, Varadarajan et al. 2017 Neuron [3] изобразил активные клетки Olig2-Cre и их потомство путем скрещивания делетера Olig2-Cre с репортерными мышами Rosa26-gfp, и данные показывают, что GFP не экспрессируется в пластине дна (см. Рисунок 2FF у Varadarajan et al., 2017 Нейрон [3]). Мы также скрестили Olig2-Cre с репортерным аллелем, определяющим Cre-опосредованную рекомбинацию, и обнаружили, что Olig2-Cre не активен в дне планшета.

Как описано рецензентом, Рис. 1H Dessaud et al., 2007 [1] ясно показывает, что Olig2 , а не , экспрессируется в MOST медиальных клетках, которые представляют собой пластинку дна. Самый вентральный домен спинного мозга, в котором Olig2 первоначально экспрессируется в этой статье [1], является доменом p3, который дает начало интернейронам V3.Важно отметить, что интернейроны V3 не экспрессируют Shh.

Взятые вместе, когда происходит формирование паттерна вентральных нейральных предшественников, Olig2-Cre является , а не активным в клетках пластинки дна, которые являются единственными типами клеток, которые экспрессируют Shh на этой стадии. Т.о., делеция гена Shh с помощью Olig2-Cre не должна влиять ни на экспрессию Shh в нервной трубке, ни на Shh-зависимое формирование паттерна вентральных доменов-предшественников, включая домен pMN.

Наконец, фенотип мышей Shh-cKO; Olig2-Cre дополнительно подтверждает мнение о том, что наблюдаемый фенотип , а не , вызван делецией Shh в пластине пола.Shh в пластине пола необходим для формирования паттерна вентрального спинного мозга, продукции pMN клеток и генерации мотонейронов и вентральных интернейронов [4]. Таким образом, если Shh в пластине пола отсутствует или снижен у Shh-cKO; Olig2-Cre эмбрионов, это приведет к полной потере или резкому сокращению предшественников Olig2 + pMN, всех типов двигательных нейронов и интернейронов V2. . Однако мы не обнаружили существенной разницы в количестве предшественников Olig2 + pMN в проанализированных Shh-cKO; Olig2-Cre и контрольных эмбрионах (рис. 3B, C), что указывает на то, что уровень Shh, секретируемый из дна, был достаточен для управления. формирование и изготовление pMN.В исправленную рукопись мы включили данные количественной оценки количества клеток Olig2 + в Shh-cKO; Olig2-Cre и контрольных эмбрионах (рис. 3B, C). Мы также обнаружили, что только двигательные нейроны FoxP1 + LMC, но ни Lhx3 + Hb9 + MMC, Isl1 + Hb9 + двигательные нейроны HMC, ни Lhx3 + Hb9 V2 были уменьшены между нейронами. у мышей Shh-cKO; Olig2-Cre (рис. 3A, C). Эти данные дополнительно подтверждают мнение о том, что Shh секретируется из пластинки дна у Shh-cKO; мышей Olig2-Cre было достаточно, чтобы управлять формированием паттерна вентрального спинного мозга и продуцированием клеток pMN, и что уменьшенный мотонейрон LMC не является вторичным результат дефектов в нейральных предшественниках.

Мы надеемся, что они решают озабоченность автора обзора тем, что наблюдаемый фенотип может быть вызван делецией Shh в предшественниках Olig2 + .

Затем рецензент №2 подчеркнул необходимость использования специфичного для мотонейрона драйвера, такого как линия Hb9-Cre. Мы уже приобрели Hb9-Cre для этой цели, но Hb9-Cre оказался проблематичным для наших экспериментов, потому что Hb9 экспрессируется (следовательно, Hb9-Cre активен) в хорде, которая секретирует Shh, необходимый для развития нервной трубки [ 5].Поскольку Hb9-Cre удаляет Shh в хорде и устраняет Shh, необходимый для формирования паттерна вентральной нервной трубки, Hb9-Cre не может быть использован для нашего эксперимента. Чтобы обойти эту проблему, мы также использовали Isl1-Cre, экспрессия Cre которого происходит, когда моторные нейроны выходят из предков. Мы генерировали Shh-cKO с Isl1-Cre и обнаружили, что Shh-cKO; Isl1-Cre мыши имеют серьезные дефициты в развитии конечностей, поскольку Isl1-Cre инактивирует Shh в развивающейся конечности [2, 6, 7]. Дефицит развития конечностей у Shh-cKO; Isl1-Cre составил наш анализ развития LMC, учитывая, что наблюдаемые дефекты мотонейронов LMC могут быть вторично вызваны тяжелыми дефектами развития конечностей.Таким образом, Hb9-Cre неадекватен для удаления Shh только в двигательных нейронах, а Olig2-Cre был лучшей линией, которую мы могли бы использовать для неактивного Shh в двигательных нейронах. Наконец, наши данные показывают, что наблюдаемые фенотипы у мышей Shh-cKO; Olig2-Cre вызваны инактивацией Shh в мотонейронах, а не удалением Shh в пластине пола, чего не происходит у Shh-cKO; Olig2-Cre мышей, как описано выше.

Другие проблемы включают отсутствие достаточного анализа, чтобы исключить дефекты формирования паттерна, пролиферации или выживания в подвергнутых манипуляции эмбрионах кур и мышей (рецензент 1 балл 1; рецензент 2 балла 5 и 6), а также недостаточную количественную оценку данных (рецензент 1 балл 2 ; рецензент 2 балла 4, 8, 14, 17, 19, 22-25).Мы рассмотрели эти проблемы, как описано ниже. В частности, что касается проблемы электропорации цыплят с использованием нокдаун-конструкции Shh, эффективность электропорации клеток дна пластины обычно очень низкая. В нашей схеме электропорации все электропорированные клетки помечены GFP. Чтобы лучше учесть опасения рецензента, мы проанализировали куриные эмбрионы, которые не экспрессируют GFP на дне чашки (следовательно, не инактивируют Shh), что было подтверждено гибридизационным анализом экспрессии Shh in situ.Мы также подтвердили, что формирование паттерна и пролиферация клеток у проанализированных куриных эмбрионов нормальны (рис. 2А, С). Эти строгие анализы исключают возможность того, что любые наблюдаемые фенотипы вызваны эффектом делеции Shh у предков.

После успешного завершения всех запрошенных исправлений мы надеемся, что вы и рецензенты сочтете эту рукопись интересной и убедительной. В частности, мы надеемся подчеркнуть, что эта история представляет по крайней мере два новаторских открытия; новая функция Shh в постмитотических нейронах и его критический нижестоящий эффектор ARHGAP36 в управлении развитием специфических типов MNs (LMC-MNs) в развивающемся спинном мозге.Наши результаты идентифицируют новую регуляторную ось, состоящую из AKT-ARHGAP36-PKA, которая играет решающую роль в передаче сигнала Shh для спецификации LMC.

Рецензент № 1:

Эта статья сообщает о новой роли Shh, продуцируемой постмитотическими мотонейронами, в спецификации латерального моторного столба (LMC) в спинном мозге цыплят и мышей. Авторы показывают, что AKT стабилизирует Rho GAP-белок ARHGAP36 в области LMC, и что ARHGAP36, в свою очередь, ингибирует активность PKA и тем самым усиливает продукцию активирующих форм Gli-белков.

Идентификация роли Shh в спецификации моторных нейронов и выяснение нисходящего пути, включающего новый регулятор и множественные сигнальные молекулы, представляет значительный интерес. Данные подтверждают выводы авторов, и работа отличного качества и хорошо представлена. У меня есть несколько просьб об улучшении данных, анализа и обсуждения, чтобы укрепить выводы документа.

Спасибо за признание того, что наши открытия предоставляют новое понимание роли передачи сигналов Shh в спецификации судьбы двигательных нейронов посредством нового нисходящего пути, включающего несколько сигнальных молекул.Мы также хотели бы поблагодарить рецензента за множество проницательных предложений. Мы рады, что смогли решить все проблемы, поднятые рецензентом №1, как описано ниже по каждому пункту рецензента.

1) Shh действует как митоген во многих системах, но авторы исключают, что это имеет место здесь, маркируя предшественники MN антителами к Olig2 и Sox2 на рисунке 2C. Однако фенотип Shh LOF на рис. 2A влияет только на генерацию небольшого меньшинства MNs, что может быть связано с дефектом пролиферации, затрагивающим только небольшую фракцию предшественников, которые не могут быть обнаружены текущим анализом.Чтобы исключить это, авторы должны исследовать пролиферирующие клетки более непосредственно, например, с помощью короткого импульса EdU. Это должно выявить предполагаемый дефект пролиферации с большей чувствительностью, чем изучение общего количества предшественников.

По предложению рецензента мы выполнили короткий импульс мечения BrdU и окрашивания Ki67. Наш анализ показал, что у мышей Shh-cKO не обнаружено значительных изменений в пролиферации предшественников по данным четырех независимых маркеров, таких как Olig2, Ki67, Sox2 и BrdU (Рисунок 3B, C и Рисунок 3 — приложение к рисунку 1B).

2) Эктопическая экспрессия ARHGAP36 в вентральном спинном мозге на фиг. 5B заметно увеличивает количество FoxP1 + LMC нейронов, в то время как нейроны Lhx3 + Hb9 + MMCm, по-видимому, не затронуты. Однако чтобы сделать вывод о том, что ARHGAP36 индуцирует нейроны LMC, а не превращает MMCm в LMC, требуется количественная оценка данных.

Мы включили количественные данные для нейронов FoxP1 + LMC и MMC (Lhx3 + Hb9 + ) (рисунок 6B).

3) Вывод эксперимента на фиг. 6A о том, что AKT стабилизирует белок ARHGAP36, должен быть усилен путем измерения периода полужизни ARHGAP36 в клетках HEK293T в присутствии и в отсутствие AKT, а также путем демонстрации того, что манипулирование активностью AKT не влияет на транскрипцию ARHGAP36.

Мы включили данные, показывающие, что период полужизни белка ARHGAP36 увеличивался в присутствии AKT при обработке циклогексимидом, который блокирует трансляцию белка (рисунок 7 — рисунок в приложении 1).

Мы также подтвердили, что ингибитор AKT снижает уровень белка ARHGAP36 с помощью вестерн-блоттинга (Рисунок 7B, Рисунок 7 — приложение к рисунку 2C), но не транскрипцию Arhgap36 с помощью RT-PCR (Рисунок 7 — рисунок приложение 2D) в эмбриональных стволовых клетках мыши. (мЭСК).

4) Регуляция экспрессии ARHGAP36 может потребовать дальнейшего обсуждения.На рис. 6 показано, что AKT контролирует стабильность белка ARHGAP36, но менее ясно, как регулируется его транскрипция. Рисунок 2 — рисунок в приложении 1 показывает снижение его экспрессии у мышей Shh cKO. Как Shh регулирует его экспрессию и есть ли другие сигналы? Вдоль той же линии стрелка между Shh и P-AKT на рисунке 7D может потребовать дополнительных пояснений.

На фиг. 7, чтобы проверить влияние активности AKT на регуляцию стабильности белка ARHGAP36, мы эктопически экспрессировали ARHGAP36 вместе с различными формами AKT путем трансфекции клеток HEK293T плазмидами, которые кодируют гены ARHGAP36 и AKT.Поскольку ARHGAP36 не экспрессируется эндогенно в клетках HEK293T, в этих клетках белки ARHGAP36 экспрессируются только из плазмиды, кодирующей ARHGAP36, в которой промотор CMV управляет транскрипцией ARHGAP36. Эти эксперименты показывают, что активный AKT увеличивает уровни белка ARHGAP36, предполагая, что AKT увеличивает белки ARHGAP36, вероятно, за счет стабилизации белка ARHGAP36, а не транскрипционной активации промотора ARHGAP36 в этих экспериментальных условиях.

Чтобы дополнительно проверить, регулируется ли эндогенная транскрипция ARHGAP36 с помощью AKT в дифференцирующихся двигательных нейронах, мы использовали систему mESC, в которой ARHGAP36 индуцируется в условиях дифференцировки двигательных нейронов.В этом состоянии ингибитор AKT не влиял на уровень мРНК ARHGAP36 (см. Ответ выше и рисунок 7 — рисунок в приложении 2D), что позволяет предположить, что AKT не участвует в транскрипционной активации гена ARHGAP36.

Тогда как Shh увеличивает уровни ARHGAP36? Примечательно, что Shh способен индуцировать активацию фосфоинозитид-3-киназы (PI3-киназы) -зависимого фосфорилирования AKT в клеточных линиях (клетки LIGHT и клетки HUBEC) [8, 9]. Мы предположили, что Shh, экспрессируемый в двигательных нейронах, запускает активацию AKT, которая, в свою очередь, стабилизирует уровень белка ARHGAP36 в двигательных нейронах.Наша модель предсказывает, что уровень белка ARHGAP36 будет снижен у мышей Shh -cKO.

Рецензент № 2:

Рукопись Nam and cols, озаглавленная «Критические роли ARHGAP36 как медиатора передачи сигналов для пути Shh в латеральной моторной столбчатой ​​спецификации», предлагает новую роль передачи сигналов Shh в развитии спинного мозга.

Предполагаемая роль активности Shh как сигнала, определяющего выбор конкретных субпопуляций MN, является новой и привлекательной.Он основан на наблюдении экспрессии Shh в постмитотических МН, что не является полностью новым, но не было хорошо охарактеризовано ранее.

Авторы также обнаружили, что член семейства Rho GAP Arhgap36 экспрессируется в постмитотических MNs, и предполагают, что он может действовать как Shh-эффектор при отборе субпопуляций MN. Ранее было показано, что в различных клеточных контекстах Arhgap36 ингибирует активность PKA, следовательно, регулирует передачу сигналов Shh. Однако было бы неплохо полностью определить его актуальность in vivo в контексте отбора конкретных субпопуляций MNs.Таким образом, рукопись содержит некоторые новые и интересные данные, однако в ней отсутствуют окончательные демонстрации некоторых выводов, сделанных авторами.

Следовательно, я считаю, что в нынешнем формате рукопись имеет важные пробелы, которые необходимо заполнить.

Мы ценим признание того, что наши находки обеспечивают новую роль передачи сигналов Shh и его эффектора ARHGAP36 в генерации специфической субпопуляции MNs, и мы хотели бы поблагодарить рецензента за множество отличных предложений.Как описано ниже, теперь мы предоставили все количественные, контрольные и другие данные, которые рецензент попросил сделать рукопись более полной.

Конкретных точек:

Чтобы предложить новую роль передачи сигналов Shh в качестве инструктивного сигнала для отбора специфических субпопуляций MNs, я полагаю, что авт. Д. Улучшить характеристики субпопуляций MN, экспрессирующих Shh.

1) В спинном мозге куриного эмбриона экспрессия Shh ранее описывалась в постмитотических мотонейронах LMC (на стадии Hh25), позднее распространяясь на MMC (стадия Hh45) (рис. 1 в Oppenheim et al., 1999). Однако Nam и cols в этой рукописи показывают экспрессию Shh, ограниченную нейронами LMC на уровне плеча. Выбранный раздел, показанный на Фигуре 1A, показывает экспрессию Shh, ограниченную mLMC (и исключенную из lLMC), а также исключенную из MMC. Могут ли авторы прояснить эти противоречивые вопросы?

Как предложил рецензент, мы повторно исследовали экспрессию Shh более тщательно с четко определенными маркерами для моторных столбцов у куриных эмбрионов (стадия Hh39) (рис. 1B).Наш анализ показывает, что Shh экспрессируется в LMCm (Isl1 + / FoxP1 + ), но не LMCl (Isl1 / FoxP1 + ) на уровне плеча, и, что интересно, он выражается в LMCl (Isl1 / FoxP1 + ) на уровне поясницы. Экспрессия Shh явно исключена из MMC (Lhx3 + MNs) на всех аксиальных уровнях, как продемонстрировано сходящимися анализами Lhx3 и Shh (Figure 1B). В целом, результаты нашего анализа экспрессии Shh очень похожи на данные в упомянутой статье (Oppenheim et al., 1999) [10], несмотря на незначительные различия, вероятно, из-за вариаций чувствительности обнаружения антисмысловых зондов Shh.

Oppenheim et al. показали хорошую экспрессию Shh у куриных эмбрионов на разных стадиях развития. На стадии Hh25 Shh экспрессируется в хорде и пластине дна, но не в постмитотических мотонейронах LMC (Figure 1A в Oppenheim et al. [10]), что похоже на то, что мы наблюдали. На стадии Hh33 обнаруживается низкий уровень Shh в брюшном роге (рис. 1C в Oppenheim et al.[10]), что может быть результатом более высокого уровня чувствительности антисмыслового зонда Shh. Оппенгейм и др. также описано, что на стадии Hh45 Shh экспрессируется в двух различных популяциях мотонейронов (MN) (медиальном и латеральном), и рефери 2 может называть эти медиальные MN как MMC. Однако эта Shh-экспрессирующая медиальная популяция MN, скорее всего, будет LMCm, судя по расположению клеточного тела. Трудно сделать вывод об идентичности моторных столбцов без анализа коэкспрессии с маркерами моторных столбцов. Таким образом, мы выполнили эти необходимые анализы коэкспрессии на рисунке 1B.

2) Панель B этого рисунка (экспрессия в эмбрионах мыши) не показывает эту ограниченную экспрессию для mLMC. Являются ли эти видовые различия специфическими? Или различия в стадиях развития?

Уровень экспрессии Shh в мотонейронах мышей намного ниже, чем в мотонейронах кур. Поскольку мы исследовали сравнимые стадии развития у эмбрионов мышей и кур, мы не думаем, что разница в уровнях экспрессии отражает различия в стадиях развития.Мы заметили, что общий анализ гибридизации in situ имеет тенденцию работать более эффективно на куриных эмбрионах, чем на эмбрионах мыши, не только для Shh, но и для многих других генов. Эти различия в чувствительности результатов гибридизации in situ могут отражать видовые различия, но нам еще предстоит понять, какие именно факторы способствуют этому наблюдению. Тем не менее, наши анализы на эмбрионах мышей и кур демонстрируют экспрессию Shh в постмитотических мотонейронах.

3) Должна быть предоставлена ​​детальная временно-пространственная экспрессия Shh в постмитотических МН.Их должно быть легко прояснить в сочетании с доступными и четко определенными маркерами для каждого столбца MN (см., Например, Adams et al., 2015)

Следуя совету рецензента, мы повторно исследовали экспрессию Shh более тщательно с четко определенными маркерами моторных столбцов у куриных эмбрионов (стадия Hh39) (Рисунок 1B). Наш анализ показывает, что Shh экспрессируется в LMCm (Isl1 + / FoxP1 + ), но не LMCl (Isl1 / FoxP1 + ) на уровне плеча, и, что интересно, он выражается в LMCl (Isl1 / FoxP1 + ) на уровне поясницы.Экспрессия Shh явно исключена из MMC (Lhx3 + MNs) на всех аксиальных уровнях, как продемонстрировано сходящимися анализами Lhx3 и Shh (Figure 1B).

Для анализа роли Shh в спецификации подтипа MN; Эксперименты с потерей функции NT куриных эмбрионов проводили с помощью электропорации на HH стадии 13 куриных эмбрионов (материалы и методы), при которых формирование паттерна NT не определенно установлено (см. например Cayuso et al., 2006).

4) Требуются контроли, показывающие количественную оценку потери Shh-, особенно потому, что дефекты оказались незначительными, несмотря на продолжительность экспериментов (96 часов после электропорации при Hh23).Например, эксперименты Gli-bs-luc, показывающие эффективность вектора Shh-LOF.

В исправленной рукописи мы количественно оценили интенсивность сигнала Shh ISH и подтвердили значительное снижение экспрессии Shh в двигательных нейронах (рис. 2C). Следует отметить, что в наших условиях электропорации эффективность электропорации клеток дна пластины обычно очень низкая, вероятно, из-за глубины и расположения электродов. Таким образом, мы ожидали, что нокдаун Shh будет наиболее эффективен в двигательных нейронах, но не в пластине пола, что позволило нам сосредоточиться на анализе влияния Shh-LOF на моторную столбчатую спецификацию без значительных изменений пролиферации предшественников или раннего формирования паттерна нервной трубки. .Наш анализ, включая тщательную количественную оценку, действительно показал, что нет значительных изменений в пролиферации (клетки BrdU + ) или формировании вентрального нервного паттерна (Olig2 + , Nkx2.2 + клетки на рис. 2A, C). Мы также обнаружили значительное сокращение мотонейронов LMCl (рис. 2B, C).

5) Более того, роль передачи сигналов Shh в пролиферации и выживании нейральных предшественников также хорошо известна, следовательно, необходим контроль, исключающий эти дефекты.

В пересмотренной рукописи мы предоставили данные включения BrdU для пролиферации и окрашивания расщепленной каспазой 3 для апоптотических клеток, и эти результаты не показывают значительных изменений в пролиферации и выживаемости нейральных предшественников (рис. 2A, C).

6) Контроли, показывающие маркеры предшественников, должны быть включены, чтобы исключить дефекты формирования паттерна.

Теперь мы предоставили данные, что вентральные клетки-предшественники устанавливаются должным образом путем окрашивания Olig2 и Nkx2.2, маркеры домена p2 и p3, соответственно, экспрессия которых зависит от уровней Shh в пластине дна (рис. 2A, C).

7) Я твердо верю, что для того, чтобы проанализировать специфическую роль передачи сигналов Shh в генерации постмитотического подтипа MN, необходимо провести эксперименты с использованием специфического для MN драйвера (например, хорошо охарактеризованного HB9), чтобы избежать дефектов формирования паттерна и пролиферации.

Мы уже пытались использовать Hb9-Cre для этой цели, но Hb9-Cre оказался проблематичным для наших экспериментов, потому что Hb9 экспрессируется (следовательно, Hb9-Cre активен) в хорде, которая секретирует Shh, необходимый для нервной системы. разработка трубки [5].Поскольку Hb9-Cre удаляет Shh в хорде и устраняет Shh, необходимый для формирования паттерна вентральной нервной трубки, удаление Shh с помощью Hb9-Cre, как ожидается, вызовет серьезные дефекты формирования паттерна и пролиферации в нервной трубке. Таким образом, Hb9-Cre нельзя использовать в нашем эксперименте. Чтобы обойти эту проблему, мы также использовали Isl1-Cre, экспрессия Cre которого происходит, когда моторные нейроны выходят из предков. Мы генерировали Shh-cKO с Isl1-Cre и обнаружили, что Shh-cKO; Isl1-Cre мыши имеют серьезные дефициты в развитии конечностей, поскольку Isl1-Cre инактивирует Shh в развивающейся конечности [2, 6, 7].Дефицит развития конечностей у Shh-cKO; Isl1-Cre составил наш анализ развития LMC, учитывая, что наблюдаемые дефекты мотонейронов LMC могут быть вторично вызваны тяжелыми дефектами развития конечностей. Таким образом, Hb9-Cre неадекватен для удаления Shh только в двигательных нейронах, а Olig2-Cre был лучшей линией, которую мы могли бы использовать для неактивного Shh в двигательных нейронах.

Чтобы дополнить анализ мышей Shh-cKO, мы также проанализировали куриные эмбрионы, у которых Shh сбивается в моторных нейронах, но не в пластине пола (рис. 2А).В наших экспериментах по электропорации цыплят эффективность электропорации клеток дна пластинки, как правило, очень низка, и все электропорированные клетки помечены GFP. Мы проанализировали куриные эмбрионы, которые не экспрессируют GFP на дне чашки (следовательно, не инактивируют Shh), что дополнительно подтверждено гибридизационным анализом экспрессии Shh in situ. Наши данные показывают, что у проанализированных куриных эмбрионов пролиферация клеток является нормальной. Мы также исследовали вентральные маркеры предшественников, такие как Nkx2.2 и Olig2, экспрессия которых зависит от уровней Shh в пластине дна, чтобы дополнительно исследовать присутствие Shh в пластине дна.Эти строгие анализы исключают возможность того, что любые наблюдаемые фенотипы вызваны эффектом делеции Shh у предков.

8) Должны быть предоставлены количественные данные, указывающие общее количество MN по сравнению с конкретными MN подтипа. Важно понимать, изменили ли LMN свою судьбу, не генерируются ли LMN.

Теперь мы предоставили количественные данные для общего количества MN и MN, специфичных для подтипа, на Рисунке 2C.Нокдаун Shh приводил к сокращению мотонейронов LMC1, не затрагивая другие подтипы моторных столбов, и, следовательно, общее количество MN было уменьшено по сравнению с неинъектированной стороной (рис. 2С). Этот результат указывает на то, что двигательные нейроны LMC не генерируются или не поддерживаются должным образом, а не переключаются на другие подтипы MN в отсутствие Shh.

9) Количественные данные на рис. 1A, панель D показывают клетки FoxP1 +, это islet1 +? Или islet1-? То же самое для Hb9, эти анализы будут различать между 1LMB и mLMC.

Количественные данные на рисунке 1A, панель E показывает клетки Lhx3 +, то же самое для комбинации с дополнительным маркером для ограничения фенотипа конкретным подтипом MN

Теперь мы предоставили количественные данные для каждого столбца двигателя, такого как LMCl (Hb9 + / FoxP1 + или Isl1 / FoxP1 + ), LMCm (Hb9 / FoxP1 + 3 или Isl1 или Isl1 ). + / FoxP1 + ), HMC (Hb9 + / Isl1 + ) и MMC (Lhx3 + / Hb9 + ) на рисунке 2C.

10) Схематическое изображение столбцов MN, включая маркеры и фенотип, будет большим подспорьем.

Мы включили схематический рисунок столбцов MN с маркерами и фенотипом на рис. 8D.

11) То же самое относится и к анализу мутантного фенотипа Shh-Olig2C. Эти эксперименты должны были быть выполнены с использованием драйвера, специфичного для MN (например, хорошо охарактеризованной линии HB9CRE, доступной в Jackson), чтобы избежать дефектов образования паттерна и распространения.

Мы выбрали драйвер Olig2-Cre для наших экспериментов с условным нокаутом, потому что предыдущая работа показала, что Olig2-Cre не удаляет ген в клетках пластинки дна [1, 11]. Shh в пластине пола необходим для формирования паттерна вентрального спинного мозга, продукции pMN клеток и генерации мотонейронов и вентральных интернейронов [4]. Таким образом, если Shh в пластине пола отсутствует или снижен у Shh-cKO; Olig2-Cre эмбрионов, мы ожидаем, что это приведет к полной потере или резкому снижению предшественников Olig2 + pMN, всех типов мотонейронов, и интернейроны V2.Однако не было существенной разницы в количестве предшественников Olig2 + pMN в проанализированных Shh-cKO; Olig2-Cre и контрольных эмбрионах, что позволяет предположить, что уровень Shh, секретируемый дном пластинки, был адекватен для формирования паттерна и продукции pMN. Мы включили данные количественной оценки количества клеток Olig2 + в Shh-cKO; Olig2-Cre и контрольных эмбрионах (рис. 3C). Мы также обнаружили, что только двигательные нейроны LMC FoxP1 + , включая LMCm и LMCl, но ни двигательные нейроны MMC (Lhx3 + Hb9 + ), ни двигательные нейроны HMC (Isl1 + Hb9 + ) не уменьшались у мышей Shh-cKO; Olig2-Cre (рис. 3C), что дополнительно указывает на то, что Shh, секретируемый из пластинки дна, был адекватен для управления формированием паттерна вентрального спинного мозга и продукции клеток pMN.

Также ознакомьтесь с нашим ответом на вопрос 7 о том, почему Hb9-Cre нельзя использовать для анализа Shh-cKO.

12) Укажите общее количество MN по сравнению с MN для конкретных подтипов. Пожалуйста, укажите, являются ли клетки FoxP1 + islet1 и Hb9 +/-.

Мы включили количественные данные для каждого столбца двигателя и общее количество MN на рис. 3C. Количество мотонейронов FoxP1 + LMC, включая как LMCm, так и LMCl, было уменьшено, но ни мотонейроны MMC (Lhx3 + Hb9 + ), ни Isl1 + Hb9 + мотонейроны HMC не были изменены в Shh. -cKO; Olig2-Cre мышей (рис. 3C), что приводит к снижению общего количества MN в Shh -cKO по сравнению с контрольными однопометниками.

Чтобы идентифицировать кандидатные эффекторные гены, авторы искали гены-мишени транскрипционного комплекса Isl1-Lhx3, ранее хорошо охарактеризованные этой группой. Какая связь между этой поисковой стратегией и передачей сигналов Shh, мне неясно, но они идентифицируют члена семейства Rho GAP Arhgap36, который, как известно, активирует транскрипционные ответы Gli посредством ингибирования активности PKA.

В то время как мы анализировали функцию Shh в столбчатой ​​спецификации, сообщалось, что ARHGAP36 активирует транскрипционные ответы Gli посредством ингибирования активности PKA.Мы исследовали паттерн экспрессии предполагаемых генов-мишеней комплекса Isl1-Lhx3 в развивающемся спинном мозге и обнаружили, что ARHGAP36 является одним из потенциальных генов MN, поскольку его экспрессия очень высока и специфична в MN.

13) Было бы неплохо увидеть среди множества генов, регулируемых транскрипционным комплексом Isl1-Lhx3, может ли существовать кластер компонентов передачи сигналов HH?

Мы не видим кластер компонентов передачи сигналов HH, регулируемых комплексом Isl1-Lhx3, кроме ARHGAP36.

14) Авторы идентифицируют HxRE гена Arhgap36 и тестируют активность in vivo с помощью экспериментов электропорации на NT куриного эмбриона. Пожалуйста, предоставьте количественные данные, указывающие количество проанализированных эмбрионов. Предоставьте количественные данные, указывающие на индуцирование эктопических клеток HB9. Пожалуйста, предоставьте временной ход электропорации, а также эксперименты с отрицательным контролем.

Мы предоставили количественные данные о количестве инъецированных эмбрионов и динамике электропорации в легенде к рисунку.Очень хорошо установлено, что электропорация Isl1 + Lhx3 индуцирует эктопические клетки Hb9 + в спинном мозге [12-14], и мы обычно проводим этот эксперимент в лаборатории. Из этой серии экспериментов мы хотели бы увидеть индукцию репортера GFP, управляемую Arghap36 -энхансером, активированным Isl1 + Lhx3 в спинном мозге. Действительно, мы смогли обнаружить очень хорошую экспрессию GFP, а также эктопические клетки Hb9 + в спинном мозге по экспрессии Isl1 + Lhx3.Мы включили данные подсчета эктопических клеток Hb9 + в спинном мозге (рис. 4F) и отрицательный контрольный эксперимент с векторной конструкцией TATA-GFP, которая не имеет HxRE и не активируется Isl1 + Lhx3 (рис. 4E).

15) Я считаю, что данные, представленные здесь, демонстрируют, что комплекса Isl1-Lhx3 достаточно для индукции экспрессии Arhgap36; является ли эта индукция прямой, полностью не продемонстрировано.

Анализ ChIP

с использованием экстрактов спинного мозга мышей показал, что Isl1 и Lhx3 сильно рекрутируются в область энхансера Arhgap36 , но не в область отрицательного контроля Untr6 (рис. 4C), что указывает на индукцию Arhgap36 с помощью Isl1-Lhx3 комплекс действительно прямой.

Следующие авторы анализируют экспрессию Arhgap36 в постмитотических нейронах. Это важный вопрос, поскольку Shh может действовать паракринным или клеточно-автономным образом, чтобы инструктировать идентичность подтипа MN.

16) Пожалуйста, предоставьте лучшую характеристику Arhgap36 в подтипах MN (совместная локализация с маркерами подтипа MN) и совместная локализация (или нет) с Shh, с клеточным разрешением.

Теперь мы предоставили подробные данные экспрессии Arhgap36 в сочетании с определенными маркерами для каждого столбца MN, такими как Arhgap36 / Isl1 / FoxP1, Arhgap36 / Isl1 / Hb9 и Arhgap36 / Lhx3 / Hb9 (в эмбрионах мыши Рисунок 5C). Arhgap36 наиболее высоко экспрессируется в области LMC1 (Isl1 / FoxP1 + ), немного в MMC-ромбовидной мышце (Hb9 + / Lhx3 low ) и очень мало в самой медиальной части MMC, но не в LMCm (Isl1 + / FoxP1 + ) на шейном уровне. На грудном уровне Arhgap36 также экспрессируется в MN PGC (FoxP1 + / Isl1 + ) и HMC (Isl1 + / Hb9 + ), хотя уровень экспрессии относительно ниже.На поясничном уровне Arhgap36 относительно высоко обогащен LMCl (Isl1 / FoxP1 + ) и показывает очень низкий уровень в самой медиальной части MMC. Чтобы изучить совместную локализацию Arhgap36 с Shh, мы выполнили in situ гибридизацию Shh и IHC Arhgap36 в спинном мозге мыши E12.5 на шейном уровне. Shh совместно локализуется с Arhgap36 в основном в области LMCl (рис. 5D).

Таким образом, Shh мыши в основном экспрессируется в LMCl спинного мозга мыши, который локализован совместно с Arhgap36 , тогда как Shh цыпленка экспрессируется в LMCm на шейном уровне и LMCl на поясничном уровне спинного мозга цыплят, где цыпленок Arhgap36 широко выражен в спинном мозге.Хотя существует несоответствие в паттернах экспрессии Shh в спинном мозге мышей и кур, Arhgap36 , по-видимому, коэкспрессируется с Shh у обоих видов, и регуляторная ось Shh-ARHGAP36 все еще может функционировать как в спинном мозге мышей, так и кур.

17) Предоставьте данные об экспрессии Arhgap36 в MN куриных эмбрионов. Было бы интересно увидеть сохранение его выражения в MN.

Гибридизация цыплят Arhgap36 in situ показала довольно широкую, но специфическую и высокую экспрессию в спинном мозге по сравнению с другими тканями куриного эмбриона (фиг. 7 — приложение к фиг. 3).

Следующие авторы проверяют, активируется ли Shh-путь при сверхэкспрессии Arhgap36. Эксперименты на NT куриного эмбриона проводили путем электропорации ARHGAP36 на куриных эмбрионах HH стадии 13 (материалы и методы). Эти эксперименты по увеличению функции вызывают избыточный рост NT, соответствующий чрезмерной активации передачи сигналов Shh, в дополнение к вентрализации всего NT. Количественные данные, указывающие на отсутствие количества проанализированных эмбрионов, время электропорации, должны быть предоставлены, а также количественная оценка маркерных эктопических клеток.

Мы предоставили количественные данные о количестве инъецированных эмбрионов, динамике электропорации в легенде к рисунку и включили количественные данные для нейронов FoxP1 + LMC и MMC (Lhx3 + / Hb9 + ) (Рисунок 6B).

18) Я считаю, что эти эксперименты контролируют способность ARHGAP36 активировать Shh-опосредованные ответы in vivo . Поскольку это ранее было задокументировано в других системах, эти эксперименты могут использоваться в качестве дополнительной информации.

Мы переместили эти данные в дополнительную информацию (Рисунок 6 — Приложение 1 к рисунку).

19) Авторы утверждают, что сверхэкспрессия ARHGAP36 в вентральном NT, собранном при 4 днях рождения, резко увеличила количество FoxP1 + LMC нейронов, что позволяет предположить, что ARHGAP36 достаточен для определения судьбы LMC. Опять же, я считаю, что эти эксперименты должны были быть выполнены с использованием специфического драйвера MN HB9, чтобы избежать дефектов формирования паттерна и распространения. При нынешнем дизайне эксперимента очень трудно определить прямую роль ARHGAP36 в отборе постмитотических субпопуляций MN, кроме роли в предшественниках MN

.

Мы использовали систему Gal4 / UAS для управления специфической экспрессией мотонейрона Arhgap36 .Мы создали конструкцию Hb9-Gal4, в которой домен трансактивации связывания ДНК Gal4 экспрессируется под действием промотора Hb9, специфичного для двигательных нейронов, и конструкции UAS- Arhgap36 , где Arhgap36 экспрессируется посредством связывания Gal4 с элементом ответа UAS. Используя эту систему, мы могли направить экспрессию Arhgap36 в постмитотические MN, и этот эксперимент также привел к специфическому увеличению FoxP1 + LMC нейронов, но не оказал никакого влияния на нейроны MMC (Lhx3 + / Hb9 + ). (Рисунок 6).

И снова в этих экспериментах требуются количественные данные, указывающие на количество проанализированных эмбрионов, временной ход электропорации отсутствует. Должна быть предоставлена ​​количественная оценка маркерных эктопических клеток.

Теперь мы предоставили количественные данные о количестве эмбрионов в легенде рисунка и данные количественной оценки для маркеров + номеров клеток на Рисунке 6.

Далее авторы показывают, что активность PKA ингибируется с помощью ARHGAP36. Однако это наблюдение не ново, поскольку Eccles et al.(2016) показали, что ARHGAP36 сочетает в себе два различных механизма ингибирования для противодействия передаче сигналов PKA; он блокирует каталитическую активность PKA и нацелен на PKAc для опосредованной убиквитином деградации, что приводит к активации пути Shh.

20) Я не вижу смысла анализировать другие цели, кроме PKA, в контексте спецификации MN, поэтому я считаю, что панели C, D, E на рисунке 5 не имеют отношения к этому контексту.

Мы переместили эти данные в дополнительные цифры (Рисунок 6 — Приложение 1 к рисунку).

21) Снова, в контексте передачи сигналов Shh / ARHGAP36 в выборе подтипа MN, я не вижу релевантности экспериментов AKT, показанных на рис. 6. Я считаю, что это должно быть удалено.

Кроме того, Zhang et al. (2019) обнаружили, что Patched1 взаимодействует с ArhGAP36 в центросоме и стабилизирует отрицательный регулятор PKA (эту статью следует процитировать в рукописи).

Zhang et al., Ось Patched1-ArhGAP36-PKA-Inversin определяет цилиарную транслокацию Smoothened для активации пути Sonic Hedgehog.Proc Natl Acad Sci U S A. 2019, 15 января; 116 (3): 874-879

Мы цитировали эту статью во введении. Поскольку путь Shh играет критическую роль в эмбриональном развитии, тканевом гомеостазе и онкогенезе, важно определить регуляторную сеть, модулирующую множество компонентов, участвующих в этом пути. Мы обнаружили, что AKT стабилизирует уровень белка Arhgpa36 и дополнительно усиливает активность Shh в генерации подтипа MN, что является довольно новым, и эта регуляторная ось может широко участвовать в различных Shh-зависимых состояниях.

22) Авторы показывают сниженную экспрессию ARHGAP36 у мышей Shh-KO (фиг. S4), опять же без каких-либо количественных данных.

Мы предоставили количественные данные (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1).

Наконец, авторы создают мутантных мышей ARHGAP36. Авторы утверждают, что на ранних стадиях развития дефекта в генерации MN не было. Необходимо предоставить количественные данные по этому контрольному наблюдению.

Мы включили данные, показывающие отсутствие дефекта пролиферации (BrdU), формирования вентрального нейрального паттерна (Nkx2.2, Olig2) и общее образование MN (Hb9) на E11.5 и предоставили количественные данные на рисунке 8 — приложение к рисунку 1.

23) Анализ фенотипа, генерируемого мутантом ARHGAP36_CRISPR в MN на плечевом и грудном уровнях развивающегося спинного мозга, снова требует количественных данных, указывающих на то, что общее количество MN не изменилось на грудном уровне.

Мы включили количественные данные HMC (Hb9 + / Isl1 + ), MMC (Lhx3 + / Hb9 + ), PGC (nNOS + ) и общее количество MN на грудном уровне (рис. 8С).

24) Количественные данные, указывающие на то, что общее количество MMC и общее количество интернейронов V2 не изменились на уровне плеч.

Мы включили количественные данные MMC (Lhx3 + / Hb9 + ) и V2-IN (Chx10 + / Lhx3 + ) на уровне плеч (рис. 8C).

25) Должны быть предоставлены количественные данные, указывающие общее количество MN в сравнении с MN конкретных подтипов. Важно понять, изменили ли LMN в отсутствие ARHGAP36 свою судьбу, не генерируются ли LMN.

Мы включили количественные данные LMCm (Isl1 + / FoxP1 + ), LMCl (Hb9 + / FoxP1 + , Lhx1 + / FoxP1 + ), HMC + ), HMC + Isl1 + ), MMC (Lhx3 + / Hb9 + ) на плечевом и грудном уровнях (Рисунок 8C). У мышей Arhgap36 KO, FoxP1 + LMC, включая нейроны LMCm и LMCl, уменьшились, в то время как не было компенсаторного увеличения мотонейронов не-LMC типа, которые мы исследовали, и затем в результате это приводит к снижению общего количества MN ( Рисунок 8C).Увеличение количества активных клеток Caspase3 + в области двигательных нейронов мышей Arhgap36 KO (фиг. 8 — приложение к рисунку 1) предполагает, что предполагаемые нейроны LMC претерпевают апоптотическую гибель клеток в отсутствие Arhgap36 . Однако остается неясным, является ли гибель клеток прямым результатом потери Arhgap36 , способствующей выживанию клеток, или косвенным результатом неудачи в получении или поддержании правильной идентичности LMC. Важно отметить, что предыдущие исследования показали, что спецификация судьбы постмитотических мотонейронов и их выживаемость тесно связаны и трудно различить фенотипы между спецификацией судьбы и выживанием постмитотических мотонейронов.После выхода из клеточного цикла «общие» двигательные нейроны диверсифицируются на отдельные подтипы двигательных нейронов, включая LMC. Передача сигналов ретиноевой кислоты (RA) играет роль в спецификации и поддержании идентичности LMC передних конечностей [15-21]. Потеря RA из моторных нейронов приводит к уменьшению количества нейронов LMC без значительного изменения количества нейронов MMC [21], как и у наших эмбрионов Arhgap36 KO. Эктопическая активация передачи сигналов RA в грудных мотонейронах нарушает дифференцировку мотонейронов не-LMC типа и в конечном итоге запускает апоптотическую гибель клеток [19].Один потенциальный механизм, который связывает спецификацию судьбы и выживаемость клеток, заключается в том, что двигательные нейроны, которые не приобрели правильную клеточную идентичность, неспособны принимать полученные от мишени нейротрофические сигналы.

Артикул:

1) Dessaud, E., et al., Интерпретация градиента морфогена sonic hedgehog с помощью механизма временной адаптации. Nature, 2007. 450 (7170): с. 717-20.

2) Harfe, B.D., et al., Доказательства основанного на расширении временного градиента Shh при определении идентичности пальцев позвоночных.Cell, 2004. 118 (4): p. 517-28.

3) Варадараджан, С.Г. и др., Нетрин1, продуцируемый нейронными предшественниками, а не клетками пластинки пола, необходим для наведения аксонов в спинном мозге. Нейрон, 2017. 94 (4): с. 790-799.e3.

4) Джессел Т.М. Спецификация нейронов спинного мозга: индуктивные сигналы и транскрипционные коды. Nat Rev Genet, 2000. 1 (1): p. 20-9.

5) Харрисон К.А. и др., Агенез дорсальной доли поджелудочной железы и аномальные островки Лангерганса у Hlxb9-дефицитных мышей.Nat Genet, 1999. 23 (1): p. 71-5.

6) Yang, L., et al., Isl1Cre обнаруживает общий путь Bmp в развитии сердца и конечностей. Развитие, 2006. 133 (8): с. 1575-85.

7) Itou, J., et al., Islet1 регулирует формирование поля задней задней конечности выше сети морфорегулирующих генов Hand2-Shh у эмбрионов мыши. Разработка, 2012. 139 (9): с. 1620-9.

8) Kanda, S., et al., Sonic hedgehog индуцирует капиллярный морфогенез эндотелиальными клетками через фосфоинозитид-3-киназу.J Biol Chem, 2003. 278 (10): стр. 8244-9.

9) Riobo, N.A., et al., Фосфоинозитид-3-киназа и Akt необходимы для передачи сигналов Sonic Hedgehog. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103 (12): p. 4505-10.

10) Оппенгейм, Р. В. и др., Модуляция ранних, но не более поздних стадий запрограммированной гибели клеток в спинном мозге эмбрионов птиц с помощью звукового ежа. Mol Cell Neurosci, 1999. 13 (5): p. 348-61.

11) Sagner, A., et al., Регуляторная динамика Olig2 и Hes во время дифференцировки моторных нейронов, выявленная с помощью транскриптомики одиночных клеток.ПЛоС Биол, 2018. 16 (2): с. e2003127.

12) Thaler, J.P., et al., LIM-фактор Lhx3 вносит вклад в спецификацию идентичности моторных нейронов и интернейронов посредством специфичных для клеточного типа белок-белковых взаимодействий. Cell, 2002. 110 (2): с. 237-49.

13) Lee, S., et al., STAT3 способствует дифференцировке двигательных нейронов за счет взаимодействия со специфическим для двигательных нейронов комплексом LIM. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110 (28): с. 11445-50.

14) Cho, H.H., et al., Isl1 напрямую контролирует холинергическую нейрональную идентичность в развивающемся переднем и спинном мозге, образуя комплексы, специфичные для определенного типа клеток.PLoS Genet, 2014. 10 (4): с. e1004280.

15) Соканатан, С. и Т.М. Джесселл, Передача сигналов ретиноидов, полученных из моторных нейронов, определяет подтипную идентичность спинномозговых мотонейронов. Cell, 1998. 94 (4): p. 503-14.

16) Соломин, Л. и др., Передача сигналов рецептора ретиноида-X в развивающемся спинном мозге. Nature, 1998. 395 (6700): с. 398-402.

17) Diez del Corral, R., et al., Противоположные FGF и ретиноидные пути контролируют вентральный нервный паттерн, дифференцировку нейронов и сегментацию во время вытягивания оси тела.Нейрон, 2003. 40 (1): с. 65-79.

18) Novitch, B.G., et al., Необходимость в опосредованной ретиноевой кислотой транскрипционной активации в формировании вентрального нейрального паттерна и спецификации мотонейронов. Нейрон, 2003. 40 (1): с. 81-95.

19) Sockanathan, S., T. Perlmann, T.M. Джесселл, Передача сигналов ретиноидных рецепторов в постмитотических мотонейронах регулирует рострокаудальную позиционную идентичность и паттерн проекции аксонов. Нейрон, 2003. 40 (1): с. 97-111.

20) Vermot, J., et al., Ретинальдегиддегидрогеназа 2 и Hoxc8 необходимы в плечевом спинном мозге мышей для спецификации мотонейронов Lim1 + и правильного распределения мотонейронов Islet1 +.Развитие, 2005. 132 (7): с. 1611-21.

21) Ji, S.J., et al., Мезодермальные и нейрональные ретиноиды регулируют индукцию и поддержание конечностей, иннервирующих спинномозговые мотонейроны.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.