Раствор для фбс блоков: Устройство фундамента ФБС, технологическая карта, план раскладки

Возведение фундамента из блоков фбс: как укладывать блоки

Сборный фундамент позволяет ускорить сроки сдачи объекта. Оптимальным вариантом являются ФБС блоки, по умолчанию имеющие высокое качество. Укладывать их необходимо в соответствии с рекомендациями типовых техкарт ТТК в зависимости от геологических условий и рельефа.

Конструкция сборного ленточного фундамента

Фундамент из ФБС блоков уступает монолитным конструкциям в пространственной жесткости. Поэтому кладка на цементно-песчаном растворе усиливается армопоясами в двух уровнях. Под блоками заливается подбетонка, поверх последнего ряда бетонируется армопояс.

Более надежной считается конструкция, в которой блоки смонтированы на плитах ФЛ, в которых армирование присутствует. Укладывать плиты и блоки можно вплотную друг к другу либо разряженным способом, что позволяет сэкономить бюджет строительства.

Внимание: Основным недостатком технологии является именно необходимость армопояса – помимо затрат на спецтехнику (блоки монтируются кранами), придется заказывать либо замешивать бетон, сооружать каркасы из арматурных стержней. Нагружать конструкцию можно лишь через 4 – 28 дней в зависимости от климатических условий.

Технология монтажа

Фундамент сооружается грузоподъемной техникой по технологии каменной кладки. Только вместо кирпича применяются крупноформатные блоки ФБС. Укладывать их следует на специальном монтажном растворе, в котором использована мелкая фракция песка. На практике чаще применяется обычный кладочный раствор с крупным песком, для обеспечения пластичности в него вводят модифицирующие добавки.

Растворные швы традиционно являются слабым местом при гидроизоляции конструкции. Поэтому рекомендуется применять пенетрирующие составы, которые делают раствор водонепроницаемым. Для малозаглубленных лент необходим полный комплекс операций, ликвидирующих морозное вспучивание глинистых грунтов:

  • щебень или песок в подстилающем слое и пазухах обратных засыпок
  • кольцевой, пристенный или пластовый дренаж
  • утепление наружной поверхности МЗЛФ и отмостки

Внимание: Промышленность выпускает ФБС нескольких типоразмеров для разной толщины стен, несущей способности фундамента. Выбор осуществляется проектировщиками в зависимости от геологии, рельефа участка.

Натурный вынос осей

Фундамент из ФБС блоков размечается в обычном порядке с учетом границ участка, «красных линий» поселковой инфраструктуры:

  • удаление от центра улицы 5 м, проезда 3 м
  • расстояние до соседского забора 3 м

Септики, колодцы коммуникаций централизованных систем водоснабжения, канализации должны отстоять от него на 4 м минимум.

Внимание: Парадный фасад обычно выходит на улицу либо развернут под прямым углом к ней.

Разметка производится шнурами по обноскам, вынесенным за пределы траншей/котлована на 1,5 м.

Выемка грунта

При разработке котлована/траншей для сборных фундаментов запрещено выравнивать дно тем же грунтом, который из них удаляется. Другими словами, если на отдельном участке произошло случайное заглубление ниже проектной отметки, ямку необходимо засыпать щебнем или песком, уплотнив эти материалы виброплитой. Либо залить на этом месте бетонную площадку при глубине больше 10 см.

Ширина траншей под фундамент из ФБС блоков должна быть больше на 1,2 м наружу, 0,6 м внутрь. Это необходимо для обеспечения доступа рабочих во время гидроизоляции, оклеивания наружной поверхности ленты экструдированным пенополистиролом, изготовлении пристенного дренажа, утепления отмостки.

Подстилающий слой

Песчаная или щебеночная подушка под фундамент, в котором использованы ФБС блоки, не нужна на гравелистых и крупнопесчаных грунтах. Во всех остальных почвах присутствует глина, опасная вспучиванием, поэтому подстилающий слой является обязательным условием. Его шина минимум вдвое больше размера ленты, при высоком уровне УГВ применяется щебень, при низких грунтовых водах – песок.

В подстилающий слой интегрируется дренажная канализация, изготовленная из гофрированных перфорированных щелями труб по схеме:

  • траншеи 50 х 50 см по периметру, объединенные в замкнутый контур
  • уклон для самотека 4 – 7 градусов в одном направлении
  • перфорация дренов по бокам и сверху в пределах 180 – 270 градусов
  • смотровые колодцы в углах, расстояние от фундамента 0,7 – 1,2 м
  • под дрены укладывается геотекстиль, засыпается 10 см слой щебня
  • затем они засыпаются этим же природным фильтром

Внимание: Дренажная система должна быть на уровне подошвы фундамента для эффективного отвода верховодки, которая неизбежно будет накапливаться в материале подстилающего слоя и обратной засыпки.

Укладка плит ФЛ

Ввиду того, что ФБС блоки не имеют армирования, фундамент усиливается под ними плитами ФЛ по технологии:

  • изготовление подошвенной гидроизоляции из Бикроста, Технониколь, прочих рулонных материалов
  • монтаж плит в углах, выравнивание горизонтального уровня в общей плоскости
  • укладка плит под сенами здания вплотную друг к другу или разряженным способом, чтобы каждый блок нижнего ряда опирался краями на две плиты
  • заполнение промежутков песком или щебнем с виброуплотнением материала или заливка бетона

Внимание: Края рулонной гидроизоляции после монтажа плит необходимо загнуть, наплавить на вертикальные или наклонные поверхности ФЛ.

Монтаж ФБС

По аналогии с классической кладкой вначале возводятся углы, затем выполняется укладка ФБС блоков порядно или уступом. Технология зависит от используемой спецтехники. Например, если кран не дотягивается до противоположной диагонали, вначале возводятся все ряды в зоне вылета стрелы. Затем грузоподъемная техника перестанавливается, достраивается противоположный угол, стены ленточного фундамента.

При монтаже сборной ленты следует учесть:

  • фундамент имеет узлы ввода коммуникаций, для которых необходимо оставить технологические проемы
  • маячные блоки монтируются в местах сопряжения наружных, внутренних несущих стен, затем заполняются прямые участки
  • во внутренних стенах необходимы дверные проемы и продухи вентиляции
  • в цокольной части фундаментов так же используются вентиляционные продухи, если планируется перекрытие по балкам

Для пола по грунту эти отверстия не нужны, так как отсутствует подполье.

Внимание: Для тяжелого оборудования, коммуникаций (печь, лестница, соответственно) применяются отдельно стоящие фундаменты, отделяющиеся от основной ленты минимум 10 см зазором.

Армопояс

Для обеспечения стабильной геометрии сборного фундамента, повышения пространственной жесткости используется армопояс. Его заливают по технологии:

  • монтаж щитов опалубки на верхний ряд блоков
  • установка арматурного каркаса с двумя поясами продольных прутков
  • укладка бетона, уплотнение глубинным вибратором смеси

Внимание: Высота армопояса обычно составляет 30 – 40 см, поэтому в нем запрещены продухи вентиляции, ослабляющие конструкцию. Поэтому их необходимо оставить в предыдущих рядах сборного фундамента.

Гидроизоляция, утепление и отмостка

Эксплуатирующимся подземным бетонным конструкциям необходима защита от влаги. Для этого все доступные поверхности обрабатываются обмазочной, штукатурной или оклеечной гидроизоляцией:

  • обмазка производится битумными, полимерными, реже эпоксидными мастиками в несколько слоев
  • для оштукатуривания применяются влагостойкие смеси
  • рулонная гидроизоляция наплавляется битумным слоем, крепится на клей или с помощью самоклеящегося слоя

Внимание: Некоторые составы несовместимы с утеплителем, так как нефтяные смолы разъедают экструдированный пенополистирол, который крепится на гидроизоляцию.

Наружное утепление позволяет защитить фундамент от промерзания, теплоизолятор под отмосткой сохраняет геотермальное тепло недр, предупреждая промерзание прилежащих к бетонным конструкциям грунтов. В сочетании с ранее выполненными работами (дренаж + подстилающий слой из нерудного материала) этого достаточно, чтобы снизить силы пучения, выдергивающие нагрузки до минимума.

Отмостка позволяет избежать интенсивного проникновения поверхностной влаги в линзы верховодки, что так же способствует ликвидации вспучивания и повышению ресурса дренажных систем.

Внимание: Отмостку следует примыкать к цокольной части фундамента с технологическим зазором. Жесткая связь может привести к неконтролируемым деформациям, раскрытию трещин или полному разрушению, как бетонной стяжки, так и фундаментной ленты.

Таким образом, собрать фундамент из ФБС блоков не представляет сложностей для индивидуального застройщика. Для снижения бюджета строительства при аренде спецтехники следует грамотно спланировать работы, чтобы избежать простоя дорогостоящего оборудования.

 

ФБС цена в Москве от производителя

Купить ФБС в Москве от производителя

ФБС 9-3-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 9-4-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 9-5-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 9-6-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 12-3-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 12-4-3

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 12-4-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 12-5-3

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 12-5-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 12-6-3

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 12-6-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 24-3-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 24-4-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 24-5-6

ЖБИ ФБС

Заказать

ФБС 24-6-6

ЖБИ ФБС

Заказать

Производство ФБС в Москве, размеры, вес

Блок Д Ш В Вес, т
ФБС 9-3-6 880 300 580 0,36
ФБС 9-4-6 880 400 580 0,48
ФБС 9-5-6 880 500 580 0,60
ФБС 9-6-6 880 600 580 0,76
ФБС 12-3-6 1180 300 580 0,51
ФБС 12-4-3 1180 400 280 0,31
ФБС 12-4-6 1180 400 580 0,66
ФБС 12-5-3 1180 500 280 0,43
ФБС 12-5-6 1180 500 580 0,83
ФБС 12-6-3 1180 600 280 0,51
ФБС 12-6-6 1180 600 580  0,99
ФБС 24-3-6 2380 300 580 0,99
ФБС 24-4-6 2380 400 580 1,32
ФБС 24-5-6 2380 500 580 1,66
ФБС 24-6-6 2380 600 580 1,99

Размеры ФБС: длина 2380, 1180, 880, ширина 300, 400, 500, 600, высота 580, 280. Согласно ГОСТ 13579-78 фундаментные блоки разделяют на 3 основных вида: блоки из тяжелого бетона ( «т»), блоки из легкого бетона («л»), блоки из силикатного бетона («с»). ФБС из тяжелого бетона изготавливаются из бетона марки М100 (В7.5). ФБС длинной 2380 мм изготавливаются из бетона М150 (В12.5) маркировка Т. Маркировка 2Т означает, что для изделия используют бетон марки М200 (В15)

Согласно ГОСТ 13579-78 название ФБС 24-6-6т расшифровывается так

  • ФБС — фундаментный блок сплошной

  • 24 (первая цифра) — длина блока 

  • 6 (вторая цифра) — ширина блока 

  • 6 (третья цифра) — высота блока, размеры в дециметрах (1 дециметр=10 сантиметроам)

  • Т — тяжелый бетон. Если эта маркировка в названии отсутствует, то фундаментный блок выполнен из других видов бетона, информация о котором указана в техническом паспорте на изделие. Все изделия ФБС снабжаются техническим паспортом, содержащим следующий минимум информации: дата изготовления ФБС; ГОСТ, морозостойкость и водонепроницаемость бетона; прочность и плотность бетона;

Рынок строительных материалов сегодня достаточно насыщен и представлен самыми различными видами. Всем известно, что фундамент – это основа здания. Именно с фундамента начинается дальнейшее строительство, поэтому от того, насколько качественно он положен, зависит то, как долго строение будет служить. Основное применение ФБС — устройство фундаментов, подвалов, цокольных этажей, а также ФБС могут использоваться для временных ограждений и для прочих нужд строительства. Ведь очень часто неправильно залитый фундамент в будущем создаёт предпосылки для разрушения стен и крыши дома, что в конечном итоге через некоторое время приводит к его полному разрушению. Чтобы этого не произошло, при строительстве фундамента обязательно нужно использовать только качественные и современные материалы.Фундаментальные блоки ФБС сегодня являются наиболее популярным строительным материалом для возведения фундамента. ФБС имеют очень простую, однако вместе с тем достаточно функциональную форму – прямоугольного параллелепипеда. ФБС могут быть совершенно разных размеров и формы, что позволяет их использовать при строительстве самого сложного фундамента. ФБС представляют собой железобетонные изделия, обладающие прекрасной прочностью. Именно в силу этого качества ФБС применяют при закладке фундамента. По сути это очень крепкий, изготовленный из самого тяжёлого бетона материал, способный выдерживать колоссальные нагрузки. В целом, на этих блоках и держится вся конструкция здания. Даже с течением времени ФБС нисколько не деформируются, тем самым не создавая причин для разрушения строения. Помимо применения ФБС в закладке фундамента, данный материал широко используют при строительстве различных подвальных помещений и погребов. Построенные из такого прочного материала, они простоят не один десяток лет. ФБС отлично подходят для эксплуатации в условиях повышенной влажности и воздействия различных химических компонентов. 

Монтаж фундаментных блоков

Для монтажа готовых бетонных блоков как правило применяется автокран либо аналогичные подъемные механизмы. Исключения составляют лишь мелкоразмерные железобетонные блочки весом до 100 кг, которые можно монтировать вручную. Рассмотрим два основных варианта монтажа фундаментов из сборных ЖБИ элементов.

 Вариант с независимым полом подвала, заливаемым после монтажа основного фундамента. Сначала разрабатывается котлован. В основании котлована делается песчаная подушка. По всей площади котлована, если планируется обустраивать подвальное помещение. Либо непосредственно по периметру внешних и внутренних стен, если не будет отливаться бетонный пол подвала. На дне котлована, на песчаную подушку, или на уложенные фундаментные подушки ФЛ (фундаменты ленточные) монтируются фундаментные бетонные блоки ФБС. Монтаж бетонных блоков ведётся вразбежку, подобно кирпичной кладке, на цементный раствор, в четыре-пять рядов в высоту. Со всеми необходимыми и возможными перевязками внутренних и внешних стен. Для этого используют фундаментные блоки разной длины ФБС 9, ФБС 12, ФБС 24. Далее, по всему периметру отливается армопояс (не обязательно) и сверху монтируют плиты перекрытия. Гидроизоляция «по вкусу». Пол подвала заливается после того, как смонтированы стены подвала из фундаментных блоков. Попросту — заливается всё пространство пола между блоками, в виде обычной стяжки, либо армированной плиты из бетона. Существенный минус такого решения — возможные подвижки этого пола-плиты в дальнейшем, потому как вес всего дома будет передаваться только на фундаментные подушки или сами блоки, но ни в коем случае на эту плиту внутри подвала. Соответственно, лента из фундаментных блоков вместе с подушками даст значительно большую усадку нежели абсолютно ненагруженная плита пола подвала.

Грамотную гидроизоляцию тоже не сделать, всё из той же независимой подвижки пола и стен. Возможны варианты с анкеровокой. Т.е. продольная и поперечная арматура будущей плиты пола подвала загоняется своими концами в стены. Для этого, лента из блоков засверливается перфоратором по всему периметру будущей плиты. В эти отверстия и заводят хвосты арматуры. В таком случае плита должна быть не тоньше 15-20 см. Однако, делать это в первый год жизни здания — всё же не стоит. Усадка ленты фундамента может нарушить целостность плиты, либо просто срежет заанкерённые хвостовики арматуры. Если речь идёт об анкеровке стандартной (в бытовом строительстве) арматурой 10-12 мм. С арматурой 16-20 мм такого казуса не произойдёт, скорее всего. В подвалах зданий, прошедших основную стадию усадки первого года, полы можно отливать без анкеровки. Но всё же более предпочтителен другой вариант.

Вариант с монолитной плитой в основании. Разрабатывается котлован. По всей площади дна котлована делают песчаную подушку. Во избежание непредсказуемых усадок, уложенный песок проливают водой, затем его тщательно утрамбовывают виброплитой.

В идеальном варианте стоит сразу позаботиться о гидроизоляции. Для этого, на утрамбованную песчаную подушку отливается предварительная плита из низкомарочного бетона м-100, толщиной примерно 7-10 см. Это так называемая подготовка. На неё укладывают рулонную гидроизоляцию (гидростеклоизол) и тщательно спаивают. Оставляя выпуски по во все стороны по 50-100 см.

Далее по всей площади котлована изготовляется арматурный каркас (поверх гидроизола). Ставится мини-опалубка по внешнему периметру будущей плиты. Плита может быть несколько больше в ширину и длину, чем будущий фундамент. Как бы с напуском в стороны. Впрочем, это не обязательно. Отливается плита из бетона м 200, м 250, или м 300. Тут уж как бюджет позволяет. Далее, на эту плиту монтируются внешние и внутренние стены подвала из фундаментных блоков ФБС. Всё так же как и в первом варианте. Стены так же обклеивают рулонной гидроизоляцией и склеивают её горелкой или паяльной лампой с нижним слоем гидростеклоизола, которую уложили на подготовку. Основные преимущества данного варианта:Целостность основания, Равномерная усадка всего фундамента и здания. Без возможных проседаний и перекосов. Жёсткая конструкция стены — пол, позволяющая сделать качественную гидроизоляцию и отделку. Увеличенная площадь опоры, и как следствие — лучшая несущая способность фундамента. Мне кажется, что перечисленных преимуществ — более чем достаточно, чтобы сделать выбор в пользу варианта с нижней плитой.

Безусловно, не стоит забывать про гидроизоляцию стен и пола фундамента. При кладке фундаментных блоков или изготовлении стяжек, в раствор из цемента добавляют различные гидрофобизаторы, порозаполнители и т.д. Раньше активно применялось «жидкое стекло». Сейчас — это скорее исключение. Иногда, используют бетоны и растворы на специальных видах цемента: напрягающий или водонепроницаемый безусадочный цемент.

Для внешней защиты стен из фундаментных блоков, часто применяют обмазочную или обклеечную гидроизоляцию материалами на основе битума. Внутреннюю гидроизоляцию — различными гидрофобизаторами и пропитками типа Кальматрона, двухкомпонентными обклеечными составами и т.д.

Вообще, в ситуации с высоким уровнем грунтовых вод, и опасностью сезонного подтопления подвалы из сборного железобетона уступают своим монолитным собратьям. Здесь сказывается сборность и неоднородность таких конструкций, где слабое звено — швы между отдельными ЖБ элементами. Возможное и смещение в период эксплуатации, когда при неграмотном монтаже или пренебрежении строительными нормами, сборные стены из ЖБИ буквально вдавливаются грунтом внутрь. В основном, это происходит при остутствии необходимых перестенков, ненадлежащем скреплении блоков цементным раствором и т.д.

Блоки фундаментные ФБС помимо своего основного предназначения, могут так же применяться при сооружений технических зданий, гаражей, складов и так далее. Часто ФБС-ки используют в качестве временных ограждений от въезда автомобилей и т.д. Безусловно они являются одним из самых рапространёных изделий ЖБИ.

Технология укладки фундаментных блоков — О цементе инфо

Для строительства различных типов зданий – промышленных или гражданских – широко применяется фундамент из бетонных блоков ФБС. Очень часто такой фундамент используют и в частном строительстве. Основное его преимущество заключено в скорости укладки, монтажа и мгновенного введения в эксплуатацию (нагрузки на конструкцию возможны непосредственно после укладки). Использование при возведении фундамента бетонных блоков ФБС дает возможность строить здания в любых климатических зонах, так как диапазон допустимых температур для ФБС от -70 до +50 градусов по Цельсию.

Фундамент из блоков ФБС вводится в эксплуатацию сразу после возведения.

Однако имеется у такого фундамента и недостаток: его стоимость получается несколько выше, чем обычного монолитного фундамента, да и наличие большого количества межблочных швов усложняет выполнение гидроизоляционных работ.

Подготовительные работы

Монтаж блоков ФБС: песчаная подушка, блоки.

Прежде чем приступить к монтажу фундамента из бетонных блоков ФБС, на отведенном участке нужно сделать геологическую разведку для определения глубины залегания нулевого цикла. После этого приступают к подготовке участка и выравниванию его поверхности. Обязательно заранее подводят все инженерные коммуникации. Если возникает такая необходимость, то занимаются устройством водоотвода будущей дренажной системы.

После того как поверхность подготовлена, приступают к разметке фундамента. Для этого используют теодолит, колышки, бечевку и строительный уровень.

Работа начинается с натягивания осевой разметки и установления точки пересечения осей.

Затем от этой точки отмеряют размеры фундамента, заложенные в проекте здания. В угловых точках вбивают металлические штыри и натягивают на них бечевку-причалку, очерчивая периметр строящегося здания.

Следующим этапом является проведение земляных работ. Роют траншеи по размерам используемых фундаментных бетонных блоков ФБС. Если по проекту здание должно быть оборудовано подвалом, то заранее выкапывают котлован, а в нем делают основание из железобетонных плит или единого бетонного монолита. Под стеновые фундаментные блоки укладывают “подушку”: тщательно трамбуют грунт, на него укладывают слой щебня и песка толщиной 5-10 см. Песчаное основание должно получиться на 20-30 см шире, чем блоки фундамента, чтобы предотвратить их свисание с подготовленной подушки.

Монтаж конструкции

Блоки монтируют при помощи спецтехники.

Для того чтобы уложить фундамент, потребуется подъемный кран. Его устанавливают таким образом, чтобы избежать обрушения вырытого котлована. Технология укладки фундаментных ФБС предусматривает первоначальное выставление маячных блоков в углах здания и местах пересечения стен на бетонный раствор. Затем нить-причалку натягивают на их грани и вдоль нее производят установку на раствор остальных фундаментных блоков. В некоторых случаях выполняют устройство для укрепления конструкции с применением металлической сетки. Для того чтобы сделать фундамент идеально ровным, как можно чаще применяют строительный уровень и отвес. Если обнаруживаются небольшие отклонения, то с помощью лома их устраняют. Когда перекосы значительные, краном вновь поднимают и отводят блок, затем тщательно его выравнивают.

Существуют блоки ФБС разных размеров.

После укладки первого ряда контролируется горизонтальность поверхности с помощью натянутых нитей. Для того чтобы сделать устройство более прочным, межблочные швы заполняют бетонным раствором, проконопатив их предварительно, чтобы раствор не вытекал наружу. Для предотвращения образования пустот между блоками нужно сделать уплотнение раствора методом штыкования. Далее начинают процесс укладки второго ряда фундаментных блоков ФБС на бетонный раствор. В зависимости от проектных расчетов готовое устройство может состоять из нескольких таких рядов с выполнением всех необходимых перевязок внутренних и внешних стен.

Если во время укладки образуются промежутки, их заполняют монолитными вставками либо доборными блоками. Необходимо предусмотреть отверстия, в которых будет производиться устройство инженерных систем (водопровод, канализация, тепло- и электроснабжение). Когда фундамент уложен полностью, нужно срезать излишки раствора на горизонтальных швах или дополнить и уплотнить в тех местах, где его недостаточно. Далее все швы расшивают с наружной стороны и заполняют их смесью с добавкой, обеспечивающей гидроизоляцию.

Затем готовый фундамент, как предусматривают правила, обтягивается с внешней стороны гидроизоляционным материалом, чтобы исключить попадание под дом грунтовых вод или влаги от дождей и тающего снега. И только после этого засыпают и утрамбовывают оставшиеся траншеи.

Допускается устройство сборного фундамента, уступающего по ширине стенам основного здания, но не более чем на 13 см.

Способ экономии средств

Есть небольшая хитрость, позволяющая снизить материальные затраты, возводя блочный фундамент для малоэтажного здания. Для этого стеновые блоки укладываются с небольшими промежутками (не более 70 см). Данные промежутки заполняют грунтом и тщательно утрамбовывают. Необходимо следить, чтобы все вертикальные швы располагались над блоками. Такие конструкции получили название прерывистого фундамента.

Основные этапы

Стандартная пошаговая инструкция по укладке ленточного фундамента включает:

  • Подготовительные работы: разметку, копание траншеи.
  • Укладку и трамбовку песчаной подушки.
  • Обустройство основы: монтаж широких плит ФБС или монолитная бетонная стяжка.
  • Укладку фундаментных блоков.
  • Гидроизоляцию и при необходимости — утепление.

Возведение столбчатого фундамента из ФБС почти ничем не отличается, за исключением заливки битумной мастики под сваи или тумбы вместо монолита из бетона. Условно все работы можно разделить на два этапа: подготовительный и непосредственно укладку блоков. Схему размещения важно сделать заранее, заполнение щелей кирпичом или бетоном допускается, но это приводит к снижению прочности конструкции. После определения и разметки главных осей, в нужные точки вбивается жесткая арматура, которая проверяется по мере разрытия траншеи на отклонение по вертикали отвесами.

Подушка под основание стандартная: не менее 10 см щебня и 5 песка (для глинистых грунтов она трехслойная, до 60 см, крупнофракционный наполнитель засыпается в качестве среднего слоя). Обязательным условием грамотной подготовки подушки является обильное увлажнение и трамбовка. Стены траншей, вырытых в сыпучих грунтах, нуждаются в защите от осыпания. Далее, на уплотненный песок заливается тонкий слой бетона (2–3 см), выжидается определенный промежуток времени до минимального набора прочности. В виде альтернативы цементной стяжке под фундаментные строительные блоки может использоваться кладочная сетка. Укладывать первый ряд разрешается только после высыхания подушки и бетонной прослойки.

Особенности технологии

Вначале формируется основание: размещаются более широкие плиты (специально приобретенные плоские или просто перевернутые). Укладывать ФБС начинают с угла и отмеченных арматурой осей. Для скрепления используется качественный цементно-песчаный раствор средней густоты или строительный клей (последний вариант предпочтительнее, но обойдется дороже). Обмазываются все без исключения щели и места соприкосновения, включая вертикальные швы, проверяется горизонтальность уровня. Свободное пространство (если оно остается) заполняется кирпичом или бетоном. Исключение составляют промежутки для труб и коммуникаций, желательно продумать их схему размещения без повреждения стеновых фундаментных блоков.

Каждый последующий ряд необходимо укладывать со смещением, по принципу кирпичной кладки. То есть вертикальный шов верхнего блока располагается строго посредине нижнего, для угловых элементов используется метод перехлеста. Толщина цементного раствора между рядами составляет 1,5 см, при недостаточной перевязке проводится армирование сеткой или прутьями.

Также рекомендуется сделать усиление фундамента из блоков металлом при строительстве на пучинистом грунте. По аналогии с первым рядом каждый последующий проверяется на отклонение уровня по горизонтали и вертикали, все пустоты заполняются раствором (последнее является важнейшим нюансом технологии).

В некоторых случаях разрешается строительство прерывистого основания (при подходящих условиях грунта, облегченной кладке и отсутствии подвала). Но максимально допустимый промежуток между ФБС не должен превышать 70 см. Такой вариант позволяет экономить до 20 % стройматериалов, но его нельзя применять при строительстве здания с числом этажей больше 2.

В идеале выбирают длинные блоки, подходящие по схеме фундамента. После застывания раствора приступают к гидроизоляционным работам, в данном случае обмазочным, верхний ряд закрывается рубероидом. При интенсивном промерзании грунта требуется дополнительное утепление основания, чаще всего пенопластом или экструдированным пенополистиролом, приступать к возведению стен разрешается через 1 месяц.

Как правильно укладывать однорядную конструкцию?

Для легких построек достаточно простого мелкозаглубленного фундамента из ФБС, но при риске смещения (в условиях пучинистого грунта) следует сделать его усиление. С этой целью траншея углубляется на 40 см, на дно засыпается подушка в 30 см из щебня твердых пород и песка. Затем делается заливка бетонной стяжки, толщиной не менее 10 см, с армированием.

Укладывать фундаментные блоки допускается только после застывания раствора, сбоку они обмазываются битумом, сверху проводится монтаж еще одного бетонного монолита с армирующим каркасом. Обязательным условием при строительстве однорядного основания является утепление отмостки.

Распространенные ошибки:

  • Покупка у непроверенного производителя.
  • Отсутствие обмазочной гидроизоляции.
  • Строительство прерывистого фундамента в зданиях с подвалом.
  • Возведение конструкции без учета будущих коммуникаций.

Советы и рекомендации

Основное преимущество ФБС связано с высокой скоростью строительства фундамента, использование максимально длинных блоков считается оптимальным (до 2,38 м). В этом случае конструкция становится более монолитной и сокращается время задействования дорогой подъемной техники.

Уплотнять фундамент следует поэтапно, для засыпки хорошо подходит речной песок, каждый слой рекомендуют смачивать и утрамбовывать. На пучинистых грунтах нецелесообразно углублять конструкцию, но всячески усиливают ее теплоизоляционные свойства (путем армирования, утепления основания и отмостки).

Технология укладки фундамента из блоков ФБС

Фундаментные блоки ФБС нашли широкое применение в строительстве. Их используют при возведении стен и обустройстве фундаментов, а также при строительстве подземных объектов. Блоки ФБС отличаются строгой геометрической формой, поэтому работать с ними легко, быстро и удобно. Кроме того, они доступны по цене, прочны и долговечны.

Рассказываем, какие виды этого материала существуют и как укладывать блоки ФБС при монтаже фундамента.

Виды блоков ФБС

Согласно ГОСТу, конструкции этого типа могут быть:

Армированными и неармированными. Последние встречаются чаще. Армированные блоки считаются более прочными и нередко изготавливаются на заказ.

Разными по размерам. Длина блоков ФБС варьируется от 380 до 2380 мм, ширина — от 240 до 2800 мм. Высота конструкций составляет, как правило, 220-600 мм.

Изготовленными из разных видов бетона. Существуют блоки из тяжелого, силикатного или керамзитового бетона.

Производители предлагают также два особых вида блоков ФБС — пустотные и с вырезами. Первые используются при возведении стен, вторые — для прокладки внутренних коммуникаций.

Технология укладки ФБС

Фундамент из этого материала обустраивается по следующей схеме:

  1. Подготовительные работы

На данном этапе копается котлован или отдельные траншеи по ширине блоков. Основание получившихся траншей выравнивается по горизонтали и засыпается слоем песка. Затем на песчаную подушку кладется рамка из брусков высотой 6-10 см. Ширина конструкции должна быть на 20 см больше самого фундамента. Рамка засыпается песком, который смачивается и тщательно утрамбовывается.

Поверх песка заливается монолитная армированная лента. Ее можно заменить фундаментными плитами ФЛ. Последние укладываются с промежутками до 70 см. Пространство, оставшееся между ними, заполняется грунтом. Этот грунт необходимо тщательно утрамбовать.

  1. Укладка ФБС

Монтаж фундаментных блоков начинают с выставления блоков-маячков. Их располагают в местах пересечения траншей. Вертикальные швы фиксируются раствором. Пустые участки, оставшиеся между блоками, заливаются бетонной смесью.

Технология укладки блоков ФБС предполагает монтаж каждого последующего ряда на слой раствора толщиной 1,5 см. Перевязка вертикальных швов должна составлять не менее 25 см. При отсутствии возможности сделать достаточную перевязку, между рядами кладут металлическую сетку либо прутки арматуры. В процессе монтажа фундамента важно оставить достаточно места для последующей прокладки труб водоснабжения и канализации.

Количество рядов при укладке фундамента из блоков ФБС составляет от двух до пяти.

  1. Завершающие работы

После монтажа всех рядов фундамента необходимо сделать опалубку и залить нижнюю часть основания бетонным раствором. После этого на подсохший раствор укладывают слой гидроизоляционного материала, после чего фундамент засыпают песком.

стратегий блокировки для IHC | Термо Фишер Сайентифик

Перед использованием специфических антител для обнаружения антигенов с помощью иммуногистохимии (ИГХ) все потенциальные сайты неспецифического связывания в образце ткани должны быть заблокированы, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител. Если блокирование отсутствует или является неадекватным, антитела или другие реагенты для детекции могут связываться с различными сайтами, не связанными со специфической реактивностью антитело-антиген. Например, антитела могут связываться со многими типами поверхностей путем простой адсорбции, и они могут связываться с белками благодаря зарядовым, гидрофобным и другим типам взаимодействий.


Введение

В принципе, любой белок, который не специфически связывается с целевым антигеном или антителами и другими реагентами для детекции, может использоваться для блокирования. Однако на практике некоторые белки работают лучше, чем другие, потому что они легко связываются с неспецифическими сайтами (также называемыми реактивными сайтами) при нейтральном pH или стабилизируют функцию других компонентов анализа. Однако ни один белок или смесь белков не подходят лучше всего для всех экспериментов IHC, и эмпирическое тестирование имеет решающее значение для получения наилучших возможных результатов для данной комбинации специфических антител и других реагентов для обнаружения. В приведенном ниже примере блокирующий буфер Thermo Scientific Blocker BSA использовался в эксперименте с флуоресцентной IHC для обнаружения белков виментина и ламина B1.


Флуоресцентная ИГХ для обнаружения виментина и ламина B1 в нормальной ткани толстой кишки. Срезы нормальной ткани толстой кишки человека блокировали блокирующим буфером Blocker BSA (кат. № 37520, 37525) перед инкубацией с мышиным анти-виментином (например, кат. № MA5-14564) и кроличьим антиламиновым B1 (например, . # MA1-06103) первичные антитела.Используемые вторичные антитела представляли собой меченный Invitrogen DyLight 405 козий антимышиный IgG (кат. № 35501BID, синий сигнал) или меченый DyLight 550 козий антикроличий IgG (кат. № 84541, розовато-оранжевый сигнал) соответственно. Ядра клеток были контрастно окрашены в зеленый цвет (например, номер по каталогу S7572)


Общие процедуры блокировки

Этап блокировки для ИГХ чаще всего выполняется после завершения всех других этапов подготовки образца, но непосредственно перед инкубацией образца с первичным антителом. Общий протокол заключается в инкубации фиксированного, встроенного, смонтированного, срезанного, депарафинированного и немаскированного образца IHC с соответствующим блокирующим буфером в течение от 30 минут до ночи при температуре окружающей среды или 4 ° C на основе оптимизированного протокола, специфичного для каждого антитела. и целевой антиген. После этапа блокировки обычно выполняется достаточная промывка, чтобы удалить избыток белка, который может помешать обнаружению целевого антигена. Однако многие исследователи не проводят промывку после этапа блокирования, потому что они разбавляют свои первичные антитела в блокирующем буфере.


Типы блокирующих буферов

Нормальная сыворотка

Нормальная сыворотка с концентрацией 1–5 % (масса/объем) является распространенным блокирующим буферным компонентом, поскольку сыворотка содержит антитела, которые связываются с реактивными участками и предотвращают неспецифическое связывание вторичных антител, используемых в анализе. Однако решающим фактором является использование сыворотки вида-источника для вторичного антитела, а не вида-источника для первичного антитела. Это связано с тем, что сыворотка первичных видов антител будет связываться с реактивными сайтами, но вторичное антитело будет распознавать эти неспецифически связанные антитела вместе со специфическими антителами, связанными с антигеном-мишенью.Кроме того, сыворотка богата альбумином и другими белками, которые легко связываются с неспецифическими участками связывания белков в образце.

Белковые растворы

Помимо сыворотки, блокирующие буферы часто содержат белки, такие как бычий сывороточный альбумин (БСА), желатин или обезжиренное сухое молоко, добавленные в конечных концентрациях 1-5% (масса/объем). Эти недорогие и легкодоступные белки по отдельности или вместе присутствуют в значительном избытке по сравнению с концентрацией антител, поэтому они конкурируют с последними за связывание с неспецифическими сайтами в образце.У многих лабораторий есть любимый рецепт самодельного блокирующего буфера. Однако важно убедиться, что такие блокирующие буферы не содержат осадков и других загрязнителей, которые могут помешать обнаружению ИГХ.

Готовые коммерческие буферы

Также доступны готовые блокирующие буферы для блокирования образцов при подготовке к обработке антителами. Эти буферы могут содержать высокоочищенные отдельные белки или запатентованные безбелковые соединения. Преимущество использования коммерческих блокаторов заключается в том, что существует множество доступных вариантов, которые работают лучше, чем желатин, казеин или другие белки, используемые по отдельности, и у них больше срок годности по сравнению с домашними препаратами.


Мы предлагаем несколько важных советов для ваших экспериментов по блокированию:

  • Контролируйте как фон (отрицательный контроль), так и силу сигнала (положительный контроль) с помощью различных блокирующих реагентов.
  • Выберите блокирующий буфер, обеспечивающий максимальное отношение сигнал/шум.
  • Убедитесь, что в блокирующем буфере нет веществ, которые мешают конкретному анализу. Например, обезжиренное сухое молоко содержит биотин и не подходит для использования с любой системой обнаружения , включающей биотин-связывающий белок.
  • Для оптимальных условий анализа используйте тот же блокирующий буфер для разбавления антитела, который используется на этапе блокирования.

  1. Дакшинамурти К., Мистри С.П. (1963) J Biol Chem 238:294.

Руководство по выбору контрольных и блокирующих реагентов.

 

Экспериментальные протоколы с использованием иммунотехнологий часто можно улучшить за счет оптимального использования блокирующих реагентов, разбавителей и контролей.Прочтите дополнительную информацию о том, как выбрать подходящие разбавители и этапы блокировки для предотвращения нежелательного фона, а также о том, как экспериментальные элементы управления могут помочь определить источник нецелевого сигнала.

 

Оптимизируйте свои экспериментальные протоколы с помощью контрольных, разбавляющих и блокирующих реагентов.

При разработке иммунотехнологии важно учитывать анализ результатов. Добавление правильных блокирующих реагентов и экспериментальных контролей может улучшить качество анализа и его интерпретацию.Включение положительных и отрицательных контролей важно при создании данных для публикации.

Используйте это руководство, чтобы узнать больше о выборе подходящих контрольных, разбавляющих и блокирующих реагентов для ряда иммунотехнологий:

• Уменьшить фон.

• Устранение неполадок с нецелевыми сигналами.

• Облегчить анализ.

Проточная цитометрия

Проблемы Решение Указанный продукт
Фон антител, связывающих Fc-рецепторы Блокирует Fc-рецепторы. Нормальная сыворотка хозяина меченого антитела
Используйте вторичное антитело F(abʹ) 2 , чтобы избежать захвата Fc-рецепторами. F(abʹ) 2 вторичные
антитела
Подтверждение того, что первичное связывание антител обусловлено антигенной специфичностью Используйте изотипический отрицательный контроль (неспецифический IgG того же вида, что и первичное антитело), ​​чтобы продемонстрировать специфическое связывание первичного антитела. Очищенные белки ChromPure™
Подтверждение того, что вторичное антитело не влияет на нецелевой сигнал Используйте изотипический отрицательный контроль (конъюгированный неспецифический IgG того же вида, что и вторичное антитело), ​​чтобы продемонстрировать специфическое связывание вторичного антитела. Очищенные белки ChromPure™
Недостаток времени и отсутствие прямого конъюгированного первичного Fab пометьте ваши первичные антитела перед инкубацией с образцом. ФабуЛайт™
Вестерн-блоттинг

Проблемы Решение Указанный продукт
Фон (неспецифический сигнал, перекрывающий интересующие полосы) Используйте соответствующий блокирующий реагент для блокирования мембраны перед инкубацией с первичным антителом. Нормальная сыворотка (5% по объему) вида-хозяина меченого антитела или БСА (5% по весу) (без IgG и без протеазы)
Избегайте использования молока или БСА, если используются первичные антитела, полученные от коз, лошадей или овец.Бычий IgG может взаимодействовать с антителом за счет гомологичных эпитопов близкородственных видов. Нормальная сыворотка (5% по объему) вида-хозяина
меченое антитело
Интерференция из-за сниженного количества иммунопреципитирующих (IP) антител при обнаружении белков 50 или 25 кДа Чтобы избежать обнаружения тяжелых цепей IP-антител с молекулярной массой 50 кДа, проведите блот-зонд с конъюгированными специфическими антителами против легких цепей. Антитела против легких цепей
Чтобы избежать обнаружения легких цепей IP-антитела с молекулярной массой 25 кДа, проведите блот-зонд с конъюгированным анти-IgG, Fc-фрагментом, специфичным после блокирования моновалентным Fab-фрагментом анти-Fc (FabuLight™). Анти-Fc-специфические антитела

Фрагменты Fab (FabuLight™)

 

Для подтверждения активности репортерного фермента добавьте небольшой образец конъюгированного вторичного фермента непосредственно к субстрату и наблюдайте за ожидаемой реакцией.

ИФА

Проблемы Решение Указанный продукт
Фон Используйте соответствующий объем блокирующего реагента, чтобы полностью заблокировать лунки перед инкубацией с первичным антителом. Нормальная сыворотка (5% об./об.) вида-хозяина меченого антитела или БСА (5% вес./об.) (без IgG и без протеазы)
Нет сигнала Используйте положительный контроль, чтобы продемонстрировать активность меченого вторичного антитела, покройте изотипом первичного антитела и непосредственно определите с помощью вторичного антитела Очищенные белки ChromPure™
Меры предосторожности при блокировании бычьим сывороточным альбумином (БСА) или молоком:

Бычий сывороточный альбумин (БСА) и сухое молоко иногда содержат бычий IgG. За исключением Bovine Anti-Goat IgG компании Jackson ImmunoResearch, многие вторичные антитела, такие как Anti-Bovine, Anti-Goat и Anti-Sheep, будут реагировать с бычьим IgG. Следовательно, использование БСА или сухого молока для блокирования или разбавления может значительно увеличить фон и/или снизить титр антител. Для блокирования используйте обычную сыворотку (5% об./об.) из
видов-хозяев меченого вторичного антитела.

Дополнительная информация о БСА, не содержащем IgG и протеаз, от Jackson ImmunoResearch.

ИХК

Проблемы Решение Указанный продукт
Подтверждение того, что первичное связывание антител обусловлено антигенной специфичностью Используйте изотипический отрицательный контроль (неспецифический IgG того же вида, что и первичное антитело), ​​чтобы продемонстрировать специфическое связывание первичного антитела. Протеины ChromPure™
Фон (общий) Блокирует эндогенные сайты связывания, которые могут взаимодействовать с экспериментальными реагентами. Нормальная сыворотка хозяина меченого антитела.
Развести антитела в буфере без белков-носителей. Отцентрифугировать рабочий раствор для удаления агрегатов. Правильный разбавитель и подготовка, т.е. PBS/Твин 20
Фон (распознавание гомологичного Ig) Используйте перекрестно-адсорбированные вторичные антитела с минимальной перекрестной реактивностью к анализируемым видам клеток или тканей. Вторичные антитела Min X
Блокируют эндогенные иммуноглобулины. Фрагменты Fab
Множественное мечение первичных антител
от одного и того же вида хозяина (например, мышь на мыши)
Используйте Fab-фрагменты в предлагаемых протоколах для выполнения множественной маркировки (см. онлайн). Фрагменты Fab
Иммунологическая метка первичного антитела перед инкубацией. ФабуЛайт™
Эндогенные ферменты Инактивация эндогенных пероксидаз перекисью водорода. Перекись водорода
Инактивация эндогенных фосфатаз левамизолом. Левамизол
Эндогенный биотин Блокирует эндогенный биотин. Инкубируйте со стрептавидином, а затем со свободным биотином.
Ионные или гидрофобные
взаимодействия
Включите моющее средство в буферы, оптимизируйте концентрацию соли и pH. Твин 20 и/или Тритон Х-100

Иммунореагенты

Компания Jackson ImmunoResearch предлагает широкий спектр иммунореагентов, предназначенных для повышения эффективности и простоты анализа.Приведенные ниже иммунореагенты выделены в этом руководстве. Посетите наш веб-сайт или ознакомьтесь с нашим каталогом для получения дополнительной информации о широком ассортименте вторичных антител и конъюгатов, производимых компанией Jackson ImmunoResearch.

• Нормальные сыворотки
• ChromPure™ Очищенные белки из нормальных сывороток
• Моновалентные Fab-фрагменты, аффинно-очищенные антитела
• Не содержащий IgG и протеаз бычий сывороточный альбумин

Если вам требуется дополнительная поддержка при выборе антител или у вас возникли проблемы с экспериментом, свяжитесь с нашей технической командой по адресу [email protected]ком.

Нормальные сыворотки

Нормальные сыворотки получают от неиммунизированных животных и, следовательно, не обнаруживают какой-либо специфический антиген. Обычная сыворотка, разбавленная до 5% (об./об.) в PBS (или аналогичном буфере), настоятельно рекомендуется в качестве блокирующего агента для снижения фона от неспецифического связывания с консервативной последовательностью и/или Fc-рецептором. Наилучшие результаты получаются с разбавленной нормальной сывороткой того же хозяина, что и меченое антитело, используемой в качестве отдельного этапа инкубации перед добавлением первичного антитела.

Просмотреть Нормальные сыворотки

Очищенные белки ChromPure™ из нормальных сывороток
Белки

ChromPure™ в основном используются в качестве экспериментальных контролей первичных или вторичных антител. Их также можно использовать в качестве блокирующих реагентов для Вестерн-блоттинга, IHC и IF. Белки ChromPure™ получают из сыворотки неиммунизированных животных и не распознают какие-либо известные антигены. Они готовятся с использованием различных хроматографических методов для получения материала без загрязняющих молекул вплоть до концентрации 20 мг/мл, что делает их идеальными для использования в качестве экспериментальных контролей для наиболее чувствительных анализов.Белки ChromPure™ доступны в различных форматах для многих видов, включая цельный иммуноглобулин, F(ab’) 2 и Fab-фрагменты.

Также доступны

человеческий IgM, сывороточный IgA и другие белки. Компания Jackson ImmunoResearch предлагает широкий спектр конъюгатов для этой линейки продуктов, в том числе ряд флуоресцентных красителей и репортерных ферментов, позволяющих изолировать сигнал, полученный в результате неспецифических взаимодействий.

Просмотреть очищенные белки ChromPure™

Фрагменты моновалентных Fab
Фрагменты

Affinity-Purified AntibodiesFab можно использовать для блокирования эндогенных иммуноглобулинов с целью снижения фонового окрашивания и двойной маркировки первичных антител одного и того же вида-хозяина.В следующем примере показано, как можно использовать Fab-фрагменты для блокирования эндогенных иммуноглобулинов при использовании мышиных первичных антител на ткани мыши.
Просмотр фрагментов моновалентных Fab

Бычий сывороточный альбумин, не содержащий IgG и протеаз

Бычий сывороточный альбумин (БСА) широко используется в качестве белка-носителя для разбавления антител и в качестве общего блокатора белка в иммуноанализах и протоколах иммунодетекции. Если BSA является желательным разбавителем или блокирующим реагентом для вашего анализа, важно использовать BSA, подходящий для этой цели.

Большинство продуктов BSA, в том числе те, которые продаются как не содержащие обнаруживаемых IgG, загрязнены низкими уровнями бычьего IgG.

Бычий IgG имеет много общих эпитопов с козьим, овечьим и лошадиным IgG и может стать мишенью для вторичных антител, направленных против этих видов (исключение составляет бычий антикозий IgG). Это может произойти и с другими антителами, которые перекрестно реагируют с бычьим IgG. Взаимодействие может привести к потере активности антител и/или увеличению фона.Фон может возникать из-за липких, растворимых иммунных комплексов или из-за неспецифического связывания контаминирующего бычьего IgG, привлекающего перекрестно реагирующие меченые вторичные антитела.

Бычий сывороточный альбумин

Jackson ImmunoResearch не содержит IgG и протеазы. Он не содержит загрязняющих IgG, что устраняет общие проблемы иммуноанализа, связанные со многими коммерческими препаратами БСА высокой чистоты. БСА без IgG поставляется в виде чистого белка, высушенного вымораживанием из деионизированной воды, в упаковках по 10 г, 50 г и 250 г.

Просмотр Бычий сывороточный альбумин

Ссылки :
Alberts B et al (1994) Молекулярная биология клетки. 3-е изд. Гирлянда Пресс. Лондон.
Калюжный А. (2016) Иммуногистохимия – основные элементы и не только. Springer International Publishing Швейцария.
Манн, М. и Дженсен, О.Н. (2003) Протеомный анализ посттрансляционных модификаций. Нац. Биотехнолог. 21, 255-261.

Конденсат-отверждающий препарат блокирует репликацию RSV in vivo

Дизайн и синтез аналогов CPM

В качестве исходного материала использовали CPM (Selleck) на основе кристаллической структуры комплекса CPM–SMO (PDB 4JKV и PDB 4O9R) 14 , на котором показаны полярные взаимодействия 3′-гидроксильной группы кольца A с аминокислотами во внеклеточном домене рецептора SMO.Мы разработали аналоги, как показано на рис. 1а и на рис. 1 с расширенными данными. Работа по синтезу была выполнена в WuxiAppTec. К раствору, содержащему СРМ (600 мг, 1,46 мМ, 1,0 экв.) в метаноле (5 мл), добавляли Boc 2 O (382,37 мг, 1,75 мМ, 402,49 мкл, 1,20 экв. ). Реакционную смесь перемешивали при 20 °C в течение 16 часов. Тонкослойная хроматография (ТСХ) (петролейный эфир/этилацетат (PE/EtOAc) = 3/1, коэффициент удерживания (Rf) = 0,45, KMnO 4 ) не показала исходного материала. Растворитель удаляли, чтобы получить остаток.Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (PE/EtOAc = 10/1) с получением промежуточного соединения (550 мг, 1,07 мМ, выход 73,62%) в виде белого твердого вещества, которое было названо CPM-IM-1 (промежуточное продукт 1). Затем к раствору CPM-IM-1 (250 мг, 488,54 мкМ, 1,0 экв.) в ТГФ (4 мл) добавляли NaH (39,08 мг, 977,08 мкМ, чистота 60%, 2,0 экв.) при 20 °C. Реакционную смесь перемешивали при 60 °C в течение 20 мин. К реакционной смеси добавляли MeI (346,72 мг, 2,44 мМ, 152,07 мкл, 5,0 экв.) и перемешивали при 60°C в течение 2 часов.ТСХ (PE/EtOAc = 3/1, Rf = 0,70, KMnO 4 ) не показала исходного материала. Реакционную смесь разбавляли водой (40 мл), экстрагировали EtOAc (25 мл × 2), промывали рассолом (30 мл), сушили над Na 2 SO 4 и концентрировали с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (PE/EtOAc = 10/1) с получением промежуточного продукта 2 (CPM-IM-2; 250 мг, 475,50 мкМ, выход 48,67%) в виде белого твердого вещества. Далее к раствору СРМ-ИМ-2 (150 мг, 285.3 мкМ, 1,0 экв) и 2,6-лутидин (91,71 мг, 855,90 мкМ, 99,68 мкл, 3,0 экв) в DCM (3,00 мл), TMSOTf (95,12 мг, 427,95 мкМ, 77,33 мкл, 1,50 экв) добавляли при 0 °С. Реакционную смесь перемешивали при 0 °C в течение 30 мин. ТСХ (PE/EtOAc = 3/1, Rf = 0,00, KMnO 4 ) не показала исходного материала. Реакционную смесь разбавляли насыщенным раствором NaHCO 3 (30 мл), экстрагировали EtOAc (30 мл × 2), промывали рассолом (30 мл), сушили над Na 2 SO 4 и концентрировали с получением неочищенного продукта. товар.Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (NH 4 HCO 3 ) с получением A3M (13,0 мг, 30,54 мкМ, выход 10,70%) в виде белого твердого вещества. A3E и A3P синтезировали по той же процедуре, показанной на рис. 1 с расширенными данными.

клеток

клеток HEp-2 (ATCC, CCL-23) поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM). Номер ATCC CCL-23 получен из клеток-загрязнителей HeLa и рекомендуется для выращивания RSV. Клетки BSRT7/5 — клетки BHK-21, которые конститутивно экспрессируют РНК-полимеразу Т7 22 , — содержали в MEM Глазго 19 .HH-сигнальный путь Клетки NIh4T3, экспрессирующие Gli-зависимую люциферазу-репортер (BPS Bioscience, 60409), поддерживали в среде DMEM. Клетки выращивали в среде с добавлением 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (ФТС) с добавлением раствора пенициллина и стрептомицина. Кроме того, 0,5 мг мл -1 генетицина добавляли к клеткам BSRT7/5 и клеткам NIh4T3, экспрессирующим Gli-зависимую люциферазу-репортер. Клетки выращивали в инкубаторе при 37 °C в 5% CO 2 . Линии клеток не были аутентифицированы.Клетки BSRT7/5 и HEp-2 дали отрицательный результат на микоплазму с использованием набора для обнаружения микоплазмы MycoAlert PLUS (Lonza).

Штаммы вируса и спасение рекомбинантного вируса

Длинный штамм RSV (ATCC, VR-26) использовали для анализа инфекции. Рекомбинантные вирусы, RSV-Luc, который экспрессирует люциферазу светлячка, и RSV-M2-1-mGFP, который экспрессирует M2-1, слитый с мономерным GFP, получали, как описано ранее 19 . Рекомбинантный RSV, экспрессирующий репортерный ген люциферазы и кодирующий замену Arg на Lys в положении 151 в белке M2-1 (RSV-M2-1(R151K)-Luc), был сконструирован с использованием вектора pACNR-rHRSV-Luc (GenBank accession , KF713491.1) в качестве матрицы для амплификации семи фрагментов, охватывающих весь геном РСВ. Фрагменты собирали вместе с фрагментом вектора p15A-Chl с использованием Gibson Assembly Master Mix (NEB, E2611). Рекомбинантный RSV-M2-1(R151K)-Luc (доступ к GenBank, MW039343), RSV-P-BFP (доступ к GenBank, MT994243) и RSV-M2-1(R151K)-P-BFP (доступ к GenBank, MT994242) были спасены. методом обратной генетики и амплифицированы в клетках HEp-2, как описано ранее 19 .

Анализ ингибирования RSV

Клетки HEp-2 высевали по 5 × 10 4 клеток на лунку в 96-луночные планшеты накануне и инфицировали 10 4 бляшкообразующих единиц (БОЕ) RSV-Luc в присутствие различных концентраций соединений.CPM (Selleck, S1146), аналоги CPM и GDC-0449 (также известный как Vismodegib; Selleck, S1082) растворяли в ДМСО при 8 мМ, 8 мМ и 10 мМ соответственно. Соединения далее последовательно разбавляли в среде DMEM, содержащей 0,25% ДМСО, до конечных концентраций в диапазоне от 20 мкМ до 0,0005 мкМ. В лунки для контроля клеток и вирусов добавляли 0,25% ДМСО. Разведения соединений предварительно инкубировали с вирусными суспензиями в течение 5 мин при 37 °C перед добавлением к клеточным монослоям в 96-луночные планшеты. Планшеты инкубировали при 37 °C в течение 24 ч для RSV-Luc перед анализом.Люминесцентные показания были выполнены с помощью люциферазной системы Bright Glo (Promega, E2610) и планшетного ридера Bioteck Synergy h2. Относительные световые единицы указывают активность люциферазы по отношению к среднему контрольному значению (выраженное в процентах). IC 50 определяли как концентрацию соединения, необходимую для достижения 50% снижения максимальной репликации вируса. Кроме того, анализы цитотоксичности проводили с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega, G7570) после инкубации с соединениями для проверки жизнеспособности клеток.50% цитотоксическую концентрацию (CC 50 ) определяли как снижение люминесценции на 50% по сравнению с контрольными лунками. Значения IC 50 и CC 50 были рассчитаны путем подгонки данных к уравнению сигмоидальной кривой в программном обеспечении GraphPad (GraphPad Prism 5).

Изоляты РСВ с минимальным лабораторным опытом

Первичные изоляты РСВ были получены в Ганноверской медицинской школе, Германия, в 2013 и 2016 гг. от детей с инфекциями дыхательных путей и мультиплексным ОТ-ПЦР-подтвержденным диагнозом инфекции РСВ 23 .Клетки HEp-2 инокулировали мазком из носа, жидкостью лаважа бронхов или материалом мазка из горла в течение 4 ч при 37°C. После перехода на свежую среду клетки инкубировали и, при необходимости, пассировали в течение нескольких дней до тех пор, пока не становилось видно сильное образование синцитиев. супернатант и клетки собирали, и ассоциированный с клетками вирус высвобождали с помощью трех циклов замораживания-оттаивания в жидком азоте. Клеточный дебрис удаляли из среды центрифугированием при 1000 g и аликвоты супернатанта быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 °C.Вирусная РНК была выделена, подвергнута обратной транскрипции, и подтипы RSV (RSV A GA2, RSV A ON1 и RSV B) были определены с помощью секвенирования по Сэнгеру гена G-белка (или секвенирования следующего поколения полного вирусного генома) и сопоставлены с известными найденными последовательностями. с помощью Nucleotide BLAST.

Анализы для проверки HH-антагонизма аналогов CPM

Скрининг соединений на HH-антагонизм был проведен в BPS Bioscience с использованием репортерной системы Gli-люциферазы 24 . Вкратце, клетки NIh4T3, экспрессирующие Gli-зависимую люциферазу-репортер, стабильно трансфицированные экспрессионной плазмидой Gli-зависимой люциферазы светлячка, высевали в белые 96-луночные микропланшеты и культивировали в течение ночи.Через 24 часа среду заменили на Opti-MEM, содержащую разведенные соединения, и клетки инкубировали еще 2 часа с последующим добавлением 1 мкг мл рекомбинантного мышиного белка SHH -1 . В качестве контроля использовали необработанные клетки. После обработки в течение 24 часов клетки лизировали и проводили анализ люциферазы с использованием системы анализа люциферазы ONE-Step (BPS bioscience, 60690). Люминесценцию измеряли с помощью люминометра (считыватель микропланшетов BioTek SynergyTM 2). Репортерные анализы выполняли в трех повторностях для каждой концентрации и анализировали интенсивность люминесценции ( L ) с использованием Graphpad Prism.Интенсивность люминесценции в отсутствие соединения использовали в качестве положительного контроля ( L p ) и оценивали как 100%. Сигнал, зарегистрированный в отсутствие клеток ( L b ), оценивали как 0%. Процент люминесценции в присутствии каждого соединения рассчитывали по следующему уравнению: Люминесценция (%) = ( L L b )/( L p L b ) . Значения процента люминесценции для различных концентраций одного и того же соединения затем наносили на график с использованием нелинейного регрессионного анализа с последующим вычислением значения IC 50 .

Количественная оценка дезорганизации IB и IBAG после обработки соединением

Клетки HEp-2 выращивали на покровных стеклах и инфицировали RSV-M2-1-mGFP или RSV-M2-1(R151K)-P-BFP при множественном заражении (MOI) 1. Через 24 часа после заражения клетки обрабатывали CPM или A3E в указанных концентрациях в течение 1 часа. FISH выполняли, как описано ранее 3 . Вкратце, клетки фиксировали 4% формальдегидом в PBS (об./об.) в течение 10 минут при 4 °C, а эндогенный биотин блокировали в PBS–1% BSA (вес. /об.) с добавлением свободного стрептавидина (4 мкг мл — 1 ) за 1 час.Покровные стекла инкубировали в гибридизационной смеси (2× SSC, 300 мМ NaCl и 30 мМ цитрата натрия), 10 % декстрана (вес/объем), 20 % формамида (об/об), 1 мг мл -1 ДНК спермы сельди и 1 мкМ зонда поли(dT) во влажной камере при 37 °C в течение 3 ч. После серийных промывок зонды выявляли путем инкубации клеток с конъюгатом стрептавидин-Alexa Fluor 647 (8 мкг мл -1 ) в PBS-1% BSA (w/v) и затем окрашивали кроличьим поликлональным анти-N антителом 3 . z — получение изображений стопки примерно 50 инфицированных клеток в каждом состоянии выполняли с использованием микроскопа WLL Leica SP8 с масляным иммерсионным объективом 63x и числовым увеличением х2.Специфическое мечение N-антител использовали для автоматического обнаружения IB в программном обеспечении ImageJ с использованием функции анализа частиц и порогового значения размера >3 мкм 2 . Затем присутствие IBAG (ов) оценивали вручную на основе сигналов M2-1-mGFP (если применимо) и поли(А) РНК.

Покадровая микроскопия и эксперименты по фотообесцвечиванию

Визуализация живых клеток и эксперименты с FRAP проводились с использованием клеток HEp-2, высеянных в микрочашки Ibidi с полимерным дном для покровного стекла, которые были инфицированы рекомбинантными вирусами (RSV–P–BFP, RSV –M2-1(R151K)–P–BFP или RSV–M2-1–mGFP) при высоком MOI в течение от 20 ч до 24 ч.Получение изображений было выполнено с использованием инвертированного конфокального микроскопа Olympus FV3000 с 60-кратным масляным иммерсионным объективом и числовым зумом × 2,5. Клетки содержались в камере с контролируемым климатом (37 ° C, 5% CO 2 ) во время визуализации. Для анализа динамики IB изображения получали каждые 30 с в течение 15–30 минут с использованием клеток, обработанных в течение 1 часа 5 мкМ CPM или 25 мкМ A3E, или ложно обработанных (ДМСО). Изображения и видео являются репрезентативными для десяти видеороликов из двух экспериментов. Были проанализированы десять 15-минутных видеороликов из двух независимых экспериментов для количественной оценки событий слияния и подвижности IB. Редактирование изображений выполнялось с использованием программного обеспечения ImageJ и Icy. IB были обнаружены с помощью плагина Spot Detector программного обеспечения Icy, а события слияния подсчитывались вручную. Максимальные скорости были получены с использованием плагина Spot Detector с опцией фильтрации по размеру и плагина Track Manager программного обеспечения Icy.

Для визуализации динамики IBAG после лечения CPM и A3E изображения получали каждые 6 с. Через 5 минут добавляли химическое соединение (5 мкМ CPM или 25 мкМ A3E) и проводили получение изображения в течение 20 минут.Видео являются репрезентативными для девяти видео из трех независимых экспериментов.

Получение FRAP было выполнено через 1 час после добавления 5 мкМ CPM, 25 мкМ A3E или ДМСО (имитация, контроль). Все эксперименты FRAP были реализованы с использованием одних и тех же настроек: 6 с до отбеливания, 5 мс обесцвечивания и 60 с после обесцвечивания при частоте кадров 1 изображение каждые 126 мс. Отбеливание проводилось в круглой области при 100% и 80% интенсивности лазера для GFP и BFP соответственно. Целевые ИБ были близки к другим контролям ИБ, которые использовались для коррекции потери флуоресценции из-за фотообесцвечивания.Среднюю интенсивность флуоресценции как функцию времени каждой обесцвеченной области получали с помощью программного обеспечения Icy. Интенсивность фона оценивали путем измерения области вне клетки как можно дальше от ИБ-мишени. Нормализация кривых восстановления выполнялась с использованием easyFRAP, автономного приложения MATLAB 25 . Для каждого экспериментального условия были проведены два отдельных эксперимента, в которых были проанализированы 12 IB. Чтобы получить изображения FRAP, показанные на рис.2, одно изображение было получено за 5 с до отбеливания, а интересующие области были обесцвечены лазерным лучом полной мощности в течение 10 мс. Затем изображения получали каждые 30 с (после первого изображения через 10 с). Редактирование изображений выполнялось с использованием программного обеспечения ImageJ и Icy.

Характеристика площади и формы RSV IB

Клетки HEp-2, выращенные на покровных стеклах, инфицировали RSV–P–BFP при множественности заражения = 1 в течение 24 ч и подвергали указанным обработкам (ДМСО, CPM или A3E) в течение 1 ч . Затем клетки фиксировали формальдегидом PBS-4% (об./об.) в течение 10 минут при комнатной температуре и пермеабилизировали PBS, содержащим 1% BSA (вес./об.) и 0.1% Triton X-100 (об./об.) в течение 10 мин. Клетки инкубировали в течение 1 часа с Hoechst 33342 (1 мкг мл -1 ) и после промывания в PBS покровные стекла помещали в реагент против выцветания ProLong Diamond (Thermofisher). z — получение изображений стопки 100 клеток на условие из 2 независимых экспериментов выполняли с использованием микроскопа WLL Leica SP8 с иммерсионным масляным объективом 63x и числовым увеличением х2. Измерения формы и площади RSV IB были выполнены с помощью программного обеспечения ImageJ с использованием функции Analysis Particles.{2}\,}\) (где a соответствует площади, а b — большой оси) каждого IB. Для множественных сравнений между различными группами лечения был выполнен дисперсионный анализ Уэлча с последующим апостериорным тестом Геймса-Хауэлла с использованием статистического языка R (https://www.r-project.org/).

Чувствительность IBs к осмотическому шоку и к обработке 1,6-гександиолом –BFP при высоком MOI.Через 24 часа после заражения клетки подвергали воздействию 5 мкМ CPM или 25 мкМ A3E в течение 1 часа при 37 °C. Получение изображений осуществлялось с помощью инвертированного конфокального микроскопа Olympus FV3000 с иммерсионным масляным объективом 60× и числовым увеличением х2,5. Клетки содержались в камере с климат-контролем (37 ° C, 5% CO

2 ) во время многопозиционной визуализации. В каждом эксперименте изучалось пять отдельных позиций, и одно изображение было получено до лечения в двух независимых экспериментах. Гипотонический шок проводили путем инкубации клеток в 10% растворе МЕМ, разведенном водой (об./об.), в течение 5 мин.Для изучения возможного восстановления ИБ после шока добавляли свежий 100% MEM и визуализировали клетки каждые 1 мин в течение 5 мин. Для оценки чувствительности к 1,6-гександиолу клетки инкубировали с 10% 1,6-гександиолом (масса/объем) и визуализировали каждые 2 минуты в течение 20 минут после обработки. Пороговое определение изображения и обнаружение IB выполнялись автоматически в программном обеспечении Icy с использованием алгоритма пороговой кластеризации Otsu из плагина Best Threshold и плагина Spot Detector путем определения минимального (0,8 мкм 2 ) и максимального (50 мкм 2 ) ROI размер.

Эксперименты с микроинъекциями

Клетки HEp-2, высеянные на покровные стекла Ibidi μ-Dish, инфицировали RSV-P-BFP в течение 24 ч и подвергали воздействию CPM, A3E или ДМСО в указанных концентрациях в течение 1 ч при 37 °C. Микроинъекции клеток осуществляли с помощью микроинжектора FemtoJet (Eppendorf), установленного на инвертированном микроскопе Olympus IX73 с использованием игл Femtotips II (Eppendorf). Тетраметилродамин-декстран (40 кДа и 70 кДа, Sigma-Aldrich) и Texas-Red-декстран (10 кДа, Sigma-Aldrich) готовили в буфере для инъекций (48 мМ K 2 HPO 4 4. 5 мМ KH 2 PO 4 , 14 мМ NaH 2 PO 4 , pH 7,2) при конечных концентрациях 6 мг мл -1 . Дектраны молекулярной массой 10 кДа, 40 кДа и 70 кДа имеют гидродинамический радиус примерно 2–3 нм, 4–5 нм и >6 нм соответственно 17 . Клетки визуализировали через 2–5 минут после микроинъекции с использованием иммерсионного масляного объектива 63×, и средние значения интенсивности флуоресценции каждой области (цитоплазма, конденсаты и фон) были получены с использованием программного обеспечения Icy.Среднюю интенсивность флуоресценции каждой области корректировали, вычитая фон (область вне клетки).

Окрашивание тиофлавином S

Клетки HEp-2 выращивали на покровных стеклах, инфицировали RSV–P–BFP в течение 24 ч, а затем обрабатывали CPM, A3E или ДМСО в указанных концентрациях при 37 °C в течение 1 ч. Затем клетки фиксировали 4% формальдегидом в PBS (об./об.) и пермеабилизировали PBS, содержащим 1% BSA (вес./об.) и 0,1% Triton X-100 (об. /об.), в течение 10 мин при комнатной температуре.Тиофлавин S (Sigma-Aldrich) растворяли в воде в концентрации 1% (масса/объем) и фильтровали перед использованием. Клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с 0,01% тиофлавина S в 10% FBS и 0,5% Tween-20 в PBS (об./об.). После серийных промывок 0,5% Tween-20 в PBS (об./об.) ядра клеток окрашивали Hoechst 33342 (1 мкг мл -1 ). Мышиные амилоидные фибриллы PrP адсорбировали на фиксированных клетках и параллельно обрабатывали в качестве положительного контроля амилоидных фибрилл в концентрации 1 мкМ. Получение изображений осуществлялось с использованием микроскопа WLL395 Leica SP8 с масляным иммерсионным объективом 63× и числовым увеличением ×4, а редактирование изображений выполнялось с использованием программного обеспечения Icy.

Анализ на основе проточной цитометрии для количественного определения минимального лабораторного опыта RSV

Клетки HEp-2 высевали по 2 × 10 4 клеток на лунку в 96-луночные планшеты за день до инокуляции вируса. Клетки инфицировали при МВД = 1 в присутствии соответствующего соединения. Через 2 часа супернатант удаляли и добавляли свежую среду, содержащую ту же концентрацию соединения. Через 24 ч после инокуляции клетки однократно промывали PBS и открепляли обработкой трипсином.Клетки промывали, центрифугировали при 400 g , ресуспендировали в фиксирующем буфере (0,5% PFA и 1% FBS в PBS) и инкубировали при 4 °C в течение не менее 30 минут или хранили в течение ночи. Затем клетки пермеабилизировали 0,1% сапонина и 1% FBS в PBS на льду в течение 20 мин. Очищенный супернатант мышиной анти-RSV-фосфопротеиновой гибридомы разбавляли 1:500 в пермеабилизирующем буфере и инкубировали с клетками на льду в течение 45 минут 26 . Затем клетки однократно промывали 1% FBS в PBS, а затем инкубировали с козьим вторичным антителом против мышиного Alexa 488 (ThermoFisher) в пермеабилизирующем буфере в темноте на льду в течение 1 часа.После двух дополнительных промывок 1% FBS в PBS клетки ресуспендировали в фиксирующем буфере и хранили при 4 °C в течение ночи. Образцы анализировали с использованием фильтра с ослаблением 99% в проточном цитометре BD Accuri C6. Результаты были проанализированы с помощью FlowJo V10. FSC-A по сравнению с SSC-A использовали для селекции живых клеток. Живые клетки, которые имели более высокий сигнал FL1-A по сравнению с окрашенными, но не инфицированными клетками, считались RSV-позитивными. Для каждой вирусной инфекции в присутствии соединения инфекцию нормализовали по инфицированным контрольным клеткам, обработанным ДМСО.

Заражение мышей и введение соединения

Самок мышей BALB/c (примерно 8-недельного возраста) приобретали в Centre d’Elevage R. Janvier. Мышей содержали в стандартных условиях с фильтрацией воздуха в животноводческом помещении, свободном от специфических патогенов, с использованием небеленого тканевого гнездового материала, а воду и пищу предоставляли без ограничений. Мышей акклиматизировали за 1 неделю до начала экспериментов. Для экспериментов по заражению мышей содержали в клетках внутри отдельных изоляционных шкафов из нержавеющей стали, которые вентилировались под отрицательным давлением воздухом, отфильтрованным с высокой эффективностью. Перед заражением мышей анестезировали смесью кетамина и ксилазина (1 мг и 0,2 мг на мышь соответственно) и инфицировали 50 мкл PBS, содержащего 6 × 10 4 БОЕ RSV–Luc или RSV–M2-1( R151K)–Luc путем интраназального введения. Для введения соединения животным соединения растворяли в фосфатно-цитратном буфере натрия (pH 3), содержащем 10% 2-гидропропил-β-циклодекстрина (масса/объем). Соединения вводили внутрибрюшинно в указанных дозах в объеме 200 мкл два раза в сутки.Контрольная группа получала только носитель.

Измерения люминесценции in vivo

Для визуализации in vivo мышей анестезировали кетамином и ксилазином, но для ежедневных экспериментов по визуализации анестезию индуцировали с помощью изофлурана в хорошо проветриваемом помещении и в системе очистки. Расчеты размера выборки и рандомизации в этих экспериментах не проводились. Вкратце, мышей помещали в камеру (XGI-8, Caliper Life Sciences), включали наркозный аппарат с потоком 100% кислорода на скорость 1. 5–2 л мин. -1 , смешанный с примерно 4–5% (об./об.) изофлюрана, доставленный в камеру для анестезии. Затем глубоко наркотизированным мышам интраназально вводили 50 мкл PBS, содержащего d-люциферин в количестве 0,75 мг кг -1 . Через 2 минуты мышей помещали спиной на пластину в системе визуализации IVIS 200 (Xenogen, Perkin Elmer) с носовым конусом, обеспечивающим 100% кислород, смешанный с примерно 1,5–2% (об./об.) изофлюрана. Программное обеспечение Living Image (v.4.0, Caliper Life Sciences) использовали для измерения активности люциферазы.Биолюминесцентные изображения были получены в течение 1 минуты с f/stop = 1 и binning = 8. Было сгенерировано цифровое изображение фотонной эмиссии мыши в искусственных цветах, и фотоны были подсчитаны в пределах постоянной интересующей области, соответствующей поверхности грудной клетки. охватывая всю область дыхательных путей. Испускание фотонов измеряли как яркость в пс -1 см -2 ср -1 .

Гистопатология мышей, инфицированных RSV

Самок мышей BALB/c после карантина помещали в индивидуально вентилируемые клетки в лабораториях уровня 2 биобезопасности WuXi AppTec.Уход за животными и их использование соответствовали протоколу использования животных, одобренному WuXi IACUC (IACUC № ID01-QD029-2020v1.0).

Соединения (CPM или A3E) вводили в дозе 15 мг кг -1 внутрибрюшинно два раза в день в течение 4 дней, начиная с 0 д.и. Мышей анестезировали смесью золетила 50 и ксилазина (30 мг кг -1 и 6 мг кг -1 соответственно) и инокулировали посредством интраназальной инъекции около 10 5 БОЕ в 50 мкл штамма RSV A2. Контрольная группа получала только носитель.Через 4 dpi мышей подвергали эвтаназии, а легочную ткань собирали и мгновенно замораживали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса в объеме, равном десятикратному весу ткани (масса/объем), для дальнейших анализов. Титрование вируса проводили, как описано ранее 13 . Супернатант гомогенатов тканей или исходный вирус использовали для инфицирования клеток НЕр-2 в 12-луночных планшетах. После 4-часовой инкубации клетки промывали и затем покрывали 0,625% легкоплавкой агарозы в DMEM с добавлением антибиотиков и 2% FBS, а затем инкубировали в течение 96 часов.Затем клетки фиксировали 4% PFA в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали, блокировали BSA при комнатной температуре в течение 1 часа и инкубировали в течение примерно 2–3 часов при комнатной температуре с мышиным моноклональным антителом против слитого белка RSV (Abcam , ab94968) в 1× TBS с последующей стадией промывки PBS-0,02% Tween-20. Комплексы антиген-антитело выявляли путем инкубации клеток в течение 2–4 ч при комнатной температуре со вторичным козьим антимышиным HRP-конъюгированным антителом (Abcam, ab6728) в 1× TBS. Затем клетки промывали PBS-0.02% Tween-20 и покрыт 4CN (4-хлор-1-нафтол) и H 2 O 2 в течение 0,5 часа. Затем планшеты промывали водой и сушили для подсчета очагов. Конечные титры RSV выражены как log 10 -трансформированных БОЕ на 1 г легкого.

Гистопатологический анализ мышей был проведен WuxiAppTec. Брали дольки легочной ткани, фиксировали в 4% PFA в течение 24 ч, а затем переносили в 70% раствор этанола. Затем образцы заливали парафином и разрезали на срезы толщиной 5 мкм.Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали под широкопольным микроскопом тремя независимыми патологоанатомами, которые не знали об экспериментальной группе животных. Воспаление и эксфолиацию легких регистрировали и оценивали полуколичественно. Степень патологических изменений оценивали по минимальной, легкой, умеренной и выраженной шкале, соответствующей цифрам от 0 до 3. правила содержания животных.Протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию при «Центре исследований Жуи-ан-Жоза» (COMETHEA) с разрешения соответствующего учреждения («Ministère de l’education nationale, de l’enseignement superieur et de la recherche»). , номер авторизации 20151006112v1 (APAFIS#1487)). Все экспериментальные процедуры проводились в помещении уровня биобезопасности 2.

Сводка отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчета об исследовании природы, связанной с этим документом.

IHC Блокировка | Протеинтек Групп

Что такое блокирование в иммуногистохимии?

Блокирование необходимо для предотвращения неспецифического связывания антител или других реагентов с тканью. Даже если антитело обладает высокой специфичностью по отношению к мишени, межмолекулярные силы могут способствовать неспецифическому связыванию с другими молекулами. Следовательно, неспецифическое связывание препятствует визуализации представляющего интерес связывания антиген-антитело.Чтобы смягчить неспецифическое связывание, перед инкубацией с первичным антителом необходимо провести стадию блокирования.

Типы блокировки IHC
Блокирование неспецифических ионных связей

Неспецифические ионные связывания обусловлены, например, ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, диполь-дипольными взаимодействиями или суммарными зарядами специфических аминокислотных групп. В этом случае изменение ионной силы буфера для разведения антител может помочь уменьшить неспецифическое связывание ионов.

Блокирование эндогенных ферментов

При использовании антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) или щелочной фосфатазой (AP), для обнаружения необходимо блокировать эндогенные уровни фермента. Обычно это относится к таким тканям, как почки, печень, кишечник, лимфоидная ткань и т. д. Пероксидазу можно заблокировать буферами, содержащими H₂O₂, а AP можно заблокировать буферами, содержащими уксусную кислоту или левамизол.

 

 

 
Блокирование белков

Как правило, для блокирования используется сыворотка (того же вида, что и вторичное антитело) или бычий сывороточный альбумин (БСА).Сыворотки и БСА могут помочь предотвратить неспецифическое связывание со многими гидрофобными боковыми цепями белков, присутствующих в ткани. Если вы окрашиваете несколькими антителами, вам необходимо использовать блокирующую сыворотку против всех используемых вторичных антител. Если используется BSA, добавление 0,1–0,5% Triton-X или Tween может помочь предотвратить неспецифическое связывание.

 
Блокирующие наконечники IHC
  1. Выберите наилучший блокирующий раствор при работе с отрицательными и положительными контрольными образцами, чтобы установить порог фонового окрашивания.

  2. Используйте блокирующий буфер для приготовления разведения антител.

  3. Убедитесь, что ваш блокирующий буфер не мешает вашему методу обнаружения сигнала.

Советы и рекомендации по блокирующим агентам

Для получения чистых и надежных результатов решающее значение имеют хорошие методы блокирования методом вестерн-блоттинга. Образцы белков сначала помещают в полиакриламидный гель для разделения белков по размеру. Затем белки переносятся на нитроцеллюлозную или ПВДФ-мембрану.Затем используется блокирующий агент для предотвращения неспецифического связывания первичных и вторичных антител с мембраной (области без интересующего белка). Надлежащие методы блокировки покрывают поверхность мембраны, не мешая связанному белку; таким образом предотвращая неспецифическое связывание антител и неспецифический сигнал (шум или фон) из-за высокого сродства мембраны к белкам.

Для правильной блокировки необходимо учитывать три фактора:

  1. Метод блокировки
  2. Блокирующий агент
  3. Буфер

Ниже приведены некоторые советы и рекомендации, которые следует учитывать, чтобы обеспечить прекрасные результаты вестерн-блоттинга.

Используйте правильные методы блокировки
  • Встряхивайте мембрану с выбранным блокирующим агентом с соответствующей скоростью (не слишком быстро/не слишком медленно) в течение 1 часа при комнатной температуре. Встряхивание необходимо для многих этапов вестерн-блоттинга (блокировка, промывка, инкубация первичных/вторичных антител). Правильная скорость обеспечит равномерную блокировку незанятых участков связывания на мембране, что предотвратит неспецифическое связывание первичных/вторичных антител.
    • Убедитесь, что мембрана размещена «белковой стороной вверх», а блокирующий буфер аккуратно омывает ее.
  • Полностью растворить блокирующий буфер: Блокирующие буферы часто готовят в спешке, но неправильно растворенные буферы могут привести к появлению черных точек на вашем вестерн-блоттинге. Чтобы избежать этого, заранее подготовьте блокирующий буфер. Если черные точки сохраняются, отфильтруйте блокирующий буфер перед использованием, чтобы удалить твердые частицы.

Выбор блокирующего агента

При выборе подходящего блокирующего агента необходимо учитывать три фактора: совместимость антител, совместимость интересующего белка и система обнаружения. Некоторые распространенные буферы блокировки и советы по их использованию перечислены ниже.

  • Обезжиренное сухое молоко (2,5–5% раствор) — наиболее часто используемый и дешевый блокирующий агент. Молоко не следует использовать, если интересующий белок фосфорилирован. Молоко содержит казеин, фосфопротеин, который связывается с антителами против фосфо, что вызывает неспецифическое связывание и высокий фоновый шум. Молоко может маскировать некоторые антигены, если их мало, что приводит к появлению слабых полос. Если появляются слабые полосы, уменьшите концентрацию до 1% в блокирующих растворах и растворах антител или замените на BSA.
  • Бычий сывороточный альбумин (БСА): Очищенный альбумин из бычьей сыворотки является вторым наиболее распространенным блокирующим агентом и используется в концентрации 2-5%. BSA можно использовать для обнаружения фосфорилированных белков. Однако препараты БСА содержат фосфорилированные соединения тирозина и вызывают сильный фоновый шум с антителами против фосфотирозина. Отфильтруйте BSA перед использованием. Нефильтрованный БСА может содержать загрязняющие IgG или сывороточные белки, которые могут вызывать фоновый шум. БСА несовместим с лектиновыми зондами, поскольку он содержит углеводы, которые увеличивают неспецифическое связывание.
  • Рыбий желатин чаще используется для иммуногистохимии, но его можно использовать и для вестерн-блоттинга в концентрациях 0,1–5 %. Рыбий желатин очищают от холодноводной рыбы и могут оставаться жидкими при более низких температурах. Желатин рыбы не вступает в перекрестную реакцию с антителами млекопитающих, поскольку не содержит белков сыворотки млекопитающих. Тем не менее, не используйте рыбий желатин с системами обнаружения авидин-биотин, поскольку он содержит эндогенный биотин.
  • Нормальная сыворотка  (бычья, кроличья, козья, мышиная и т. д.) встречается реже, поскольку используется в более высоких концентрациях (5-10%) и стоит дороже, чем молоко или БСА. Нормальная сыворотка несет иммуноглобулины, которые связываются с реактивными участками на мембране, что предотвращает неспецифическое связывание меченых антител IgG. Используйте сыворотку того же вида, что и вторичное антитело. Не используйте сыворотку того же вида, что и первичное антитело, поскольку это может привести к неспецифическому связыванию первичных антител через мембрану.
  • Патентованные коммерческие буферы содержат чистые фракции патентованного белка без альбумина, иммуноглобулинов, фосфопротеинов или биотина.Коммерческие буферы работают эффективно и дают высококачественные результаты, поэтому на блокировку тратится меньше времени. Доступны специальные протоколы для каждого коммерческого буфера.
  • Не содержащие белка блокирующие агенты
    • Поливинилпирролидон (ПВП) представляет собой альтернативу буферу, не блокирующему белки, который полезен для обнаружения небольших белков. PVP представляет собой водорастворимый полимер, который связывается с мембранами из нитроцеллюлозы и PVDF. ПВП обычно используется в концентрации 0,5-2% и обычно сочетается с очищенным казеином или другими блокирующими агентами.

Какой буфер использовать? Блокирующие буферы

используются для разбавления блокирующего агента и антител. Они состоят из солевого раствора с детергентом или без него (Tween 20, 0,05%) и блокирующего агента. Солевые растворы включают трис-буферный раствор (TBS; 50 мМ Трис и 150 мМ NaCl, pH 7,6) и фосфатно-солевой буфер (PBS, 140 мМ NaCl, 10 мМ фосфатный буфер и 3 мМ KCl, pH 7,4). Для большинства приложений они могут использоваться взаимозаменяемо, но в определенных условиях может потребоваться использование одного буфера вместо другого.

  1. PBS может влиять на щелочную фосфатазу, поэтому следует использовать TBS, если щелочная фосфатаза используется в качестве последующего субстрата.
  2. Низкие концентрации Tween 20 в блокирующем буфере и буфере для антител используются для предотвращения слабого неспецифического связывания. Специфическое связывание антител является сильным и не должно быть нарушено.
    • Растворы, содержащие детергенты, могут способствовать росту микробов, поэтому TBS или PBS с Tween должны быть приготовлены свежими перед использованием.
    • Для оптимальных условий анализа используйте тот же блокирующий буфер для разбавления антитела, который используется на этапе блокирования.

 

Другие советы и рекомендации по улучшению результатов вестерн-блоттинга:

Посещаемость футбольных клубов снижается седьмой сезон подряд до самого низкого среднего показателя с 1981 года

В Арканзасе есть простое решение для продолжающегося кризиса посещаемости студенческого футбола: Просто выиграй (по-крупному), детка.

Razorback Nation так полюбила тренера Сэма Питтмана, что Арканзас занял второе место по посещаемости среди команд FBS в 2021 году — колоссальные 14 353 болельщика за игру по сравнению с последним полным сезоном 2019 года. «Хогс» завершили свой лучший сезон за десятилетие (9-4) после старта со счетом 4-0, который включал в себя первую домашнюю победу над Техасом за 40 лет.

Арканзас также является крайним исключением. Посещаемость FBS в прошлом сезоне достигла самого низкого уровня за те же четыре десятилетия, согласно ежегодным данным, собранным NCAA. Средний показатель для 130 команд дивизиона снизился до 39 848 болельщиков за игру. Это самый низкий показатель с 1981 года, когда средний показатель составлял 34 621 человек.

По стране средняя посещаемость в 2021 году снизилась на 15%, более чем на 7000 человек за игру, по сравнению с рекордной отметкой 46 971 в 2008 году.

Имеются отягощающие факторы. Наиболее примечательными являются тревожное возвращение некоторых фанатов, обеспокоенных большими толпами и COVID-19, а также растущий список прыгунов на подножках небольших стадионов, переходящих из FCS в FBS. Также проще и дешевле смотреть игры по телевизору дома.

Тем не менее, по словам комиссара Комиссии по ценным бумагам и биржам США Грега Сэнки (Greg Sankey), это больше, чем тенденция, которая продолжает определять спорт в 21 веке.

«Если хотите, в мире студенческого спорта много негатива», — сказал он.«Люди говорили: «Ну, эти решения не повлияют на интерес фанатов». Что-то, конечно, есть. Это не только телевидение. Это не только COVID. Нам нужно переосмыслить наш подход к ключевым вопросам. Это почти момент Капитана Очевидность».

В наш век прав на изображение и подобие имени, портала передачи и судебных баталий это служит напоминанием о том, что игра не слишком велика, чтобы потерпеть неудачу.

Сентябрьские игры иногда начинаются в разгар полудня, чтобы приспособиться к сети. Некоторые школы все еще расширяют полосу пропускания стадиона, чтобы болельщики могли пользоваться мобильными телефонами на трибунах.В целом, колледжи не могут легко построить новый стадион взамен устаревшего, учитывая их ограниченную территорию кампуса. Таким образом, реновация правит днем, но не каждый может потратить 500 миллионов долларов, как это сделала Texas A&M, на расширение стадиона. Также остается борьба за привлечение студентов.

«В каком-то смысле игра не рассчитана на болельщиков, решивших посетить игру лично», — сказал Крис Бевилакуа, один из самых уважаемых консультантов по спортивным СМИ в индустрии.

Это все еще может дойти до основ.Стареющим болельщикам, столкнувшимся с растущими ценами на билеты, парковку и льготы, легко перейти к настройкам по умолчанию в день игры. Для более молодых фанатов с более короткой продолжительностью концентрации внимания важно удерживать внимание, и точка.

«Мы действительно конкурируем с 70-дюймовым телевизором и пивом, которое остыло в вашем холодильнике, и без очередей в туалете», — сказал комиссар «Большой 12» Боб Боулсби. «Мы должны продолжать улучшать впечатления от игрового дня».

Прошлый сезон стал седьмым подряд и девятым из последних 10 лет, когда посещаемость FBS снизилась.NCAA отслеживает посещаемость FBS с 1976 года, за два года до того, как был создан тогдашний Дивизион I-AA (подразделение футбольного чемпионата).

Сокращение числа болельщиков за игру на 1629 человек в 2021 году является самым резким за всю историю, падение на 3,93% по сравнению с 2019 годом. NCAA не собирала статистику посещаемости сезона 2020 года, затронутого COVID-19, впервые с тех пор, как оно начало вести учет общей посещаемости. данные за 1948 год. Данные за 2021 год включают посещаемость дома, игры на нейтральной площадке и игры в чашу.

ФБС посещаемость снижается

два тысячи четырнадцать 44603 -1068 -670 -321 -1409 41 856 -347 -379

2015

43933

2016

43612

2017

42203

2018

2019

41477

2021

39848 *

-1629

* Самая низкая с 1981

снижение избавлены ни часть страны. Посещаемость более половины команд, вошедших в финальный список AP Top 25, снизилась, в том числе восьми из топ-10. Уже седьмой год подряд на большинстве конференций FBS (семь из 10) снизилась посещаемость. Сравните это с 2010 годом, когда только Pac-12 видел меньше фанатов, посещающих игры среди крупных конференций.

В 2021 году только «Большая десятка» продемонстрировала рост посещаемости среди конференций Power Five. Мичиган возглавляет страну по посещаемости пятый год подряд и в 21-й раз за последние 22 сезона.

Уже 23-й год подряд Комиссия по ценным бумагам и биржам возглавляет страну по посещаемости с 72 195 болельщиками за игру. Тем не менее, самая безумная футбольная лига страны не застрахована от этой тенденции. Посещаемость SEC снижается пятый год подряд с рекордно высокого уровня в 78 630 человек в 2015 году. Несмотря на то, что среднее снижение по сравнению с 2019 годом было минимальным (528 болельщиков за игру), SEC зафиксировала самый низкий средний показатель посещаемости с 1999 года.

Девять из 14 команд лиги столкнулись со снижением посещаемости, от любопытного до резкого.В год чемпионата Грузия потеряла посещаемость, хотя это было микроскопическое падение — 71 болельщик за игру. Южная Каролина теряла более 8000 болельщиков за игру (начиная с сезона 4-8 в 2019 году), несмотря на кампанию восстановления, в которой тренер Шейн Бимер финишировал 7-6.

1 9009

9009

42,599

42,599

Mac

Sec

70098

70099

-0.007

Самые низкие с

Большой десять

65 252

+0.003

самый высокий с ’18

Big 12

-4.3

-4.3

самый низкий с ’00

PAC-12 43 865 — 4.8 самых популярных *

ACC

-11,7

самый низкий с ’90

Независимые
Независимые 32,146 -13. 2 самый низкий с ’01

AAC

28592

-3 00

MWC

21 401

-799 9000

-7,9

Самые низкие 40099

18 410 +0.04 +0.04

C-USA

18 048

-11.5

самые низкие 40099 9009

17 40098

17 456

+12.4

самый высокий с ’06

* С момента создания американца (2013) , Mountain West (1999 г.), Conference USA (1996 г.)

В Арканзасе сейчас не так много беспокойства по поводу посещаемости. Только у Рутгерса, набравшего 14 458 болельщиков за игру, средний прирост в 2021 году был выше.Бейсбольная команда Арканзаса, занимающая второе место, только что набрала 30 000 человек в серии из трех игр со штатом Иллинойс. Баскетбольная команда Эрика Массельмана только что увидела 19 000 зрителей на субботней победе над Теннесси.

На стадионе Razorback в 2021 году снова было шумно, в среднем его посетило 65 284 болельщика, что является рекордом, по крайней мере, с тех пор, как стадион был расширен в 2018 году. Прогнозируемые абонементы на 2022 год (45 000) на 10 000 больше, чем два года назад, катастрофические 2 -10 сезон. Ожидается, что выручка от билетов вырастет до 36 миллионов долларов с 10 миллионов долларов.

Вооружившись этой шумихой и обещаниями, домашнее расписание на 2022 год может стать собственным документальным фильмом Netflix; Алабама, Оле Мисс и LSU приезжают в город, а Бобби Петрино возвращается вместе со своей командой из штата Миссури.

«В этом году все встало на свои места, — сказал спортивный директор штата Арканзас Хантер Юрачек. «Честно говоря, это связано с тем, что наша фанатская база является единственной командой Power Five в штате, у которой нет другой профессиональной команды в штате».

Лишь несколько школ соответствуют этому профилю.И, да, победа заполняет места. Да, верно? Не обязательно в спорте, в котором и в лучшие времена были проблемы с определением тенденций.

Несмотря на спад в 2019 году, у Южной Каролины был домашний график, в который входили Оберн, Клемсон и Флорида. После увольнения Уилла Мушампа в 2020 году Gamecocks были лучше в 2021 году, но домашнее расписание также включало Восточный Иллинойс, Троя и Вандербильта. Это способствовало падению на 8 228 за игру на стадионе Williams-Brice, пятому по величине снижению в стране и самому большому в SEC.

Оле Мисс впервые одержала 10 побед в регулярном сезоне. Неудивительно, что сочетание успеха и яркого Лейна Киффина привело к тому, что на трибунах за игру появилось на 8 239 болельщиков больше (третье место в национальном рейтинге). Повстанцы перешли от 18-летней низкой отметки посещаемости в 2019 году (48 233) до более чем 56 000 в 2021 году.

Тем не менее, успех не всегда привлекает болельщиков. В сезоны чемпионатов конференций Мичиган, Цинциннати и Бэйлор потеряли посещаемость. Посещаемость АКК в целом снизилась почти на четверть (23.5%) с рекордно высокого уровня в 2004 году (55 735 за игру). За это время лига расширила свое присутствие за счет реорганизации и в среднем собирала более одной чаши «Новогодней шестерки» в год, в то время как Клемсон стал национальной державой.

Падение посещаемости по стране остается реальным и продолжающимся. Администрация давно заботится об удержании студентов. Если студенты не ходят на игры, у них меньше эмоциональной привязанности, когда дело доходит до отдачи своей альма-матер в годы своего пика заработка.

«Посмотрите на возрастной диапазон от 25 до 40 лет», — добавил Боулсби. «Они более склонны отдавать свои пожертвования на что-то другое, кроме легкой атлетики. Они не совсем склонны выделять шесть суббот осенью».

В некоторые игровые дни телевидение по-прежнему остается запредельным фаворитом, а не сидячими местами. Есть причина, по которой в ближайшие три года «Большая десятка», «Большая 12» и «Pac-12», как ожидается, добьются больших успехов в переговорах о правах на СМИ. Новое соглашение SEC с ESPN/ABC начинается в 2024 году.

«Иногда я ловил себя на том, что во время сезона [когда] я не хочу идти на игру, потому что мне нравится смотреть три или четыре игры, которые идут телевидению», — сказал Тодд Берри, исполнительный директор Ассоциации тренеров по американскому футболу.

По поводу игрового опыта у Берри были те же жалобы, что и у среднего фаната: «В конечном итоге это будет 30 снэпов и долгая рекламная пауза. надувной мяч [на поле во время этих перерывов]… до того, как он начнет терять свою развлекательную ценность».

Некоторое влияние COVID-19 продолжилось и в 2021 году, но его можно измерить только психологически. Несмотря на то, что подавляющее большинство стадионов были открыты на 100 % в связи с пандемией 2020 года, наверняка существовала часть болельщиков, которые беспокоились о большом скоплении людей.

Снизить среднее значение имеют 15 команд, присоединившихся к FBS с 2000 года. Средняя вместимость этих стадионов чуть больше 30 000 … или меньше, чем Midnight Yell в Texas A&M. Ни одна из этих школ не входит в лигу Power Five и не участвовала в крупных турнирах. С 1988 года FBS выросла на 25% со 104 до 130 школ.

Студенческий футбол еще не достиг стадии «перенасыщения», когда в эфире слишком много контента, согласно отраслевым источникам. Это серьезная критика студенческого баскетбола, поскольку зрители в значительной степени сосредоточены на «Мартовском безумии».

Футбол на телевидении остается здоровым. По данным Sports Media Watch, тринадцать из 14 телепередач с самым высоким рейтингом в прайм-тайм в 2021 году были играми НФЛ. Самая популярная футбольная игра колледжа заняла 15-е место; это был полуфинал плей-офф студенческого футбола между Клемсоном и штатом Огайо. Прошлогодний национальный чемпионат CFP, Алабама против штата Огайо, занял 16-е место. Ни одна другая игра колледжей не попала в топ-100. По данным Sports Media Watch, национальный чемпионат CFP в прошлом месяце между Алабамой и Джорджией повысил рейтинги по сравнению с предыдущим годом, что было наименее просматриваемой игрой чемпионата эпохи BCS (с 1998 года).

«В ближайшем будущем никому не нужно будет разыгрывать преимущества для сетей», — сказал CBS Sports ветеран спортивного телевидения. «Если бы все было так плохо, люди не требовали бы прав на эти игры. К тому же интерес к играм растет.

Бевилаква также является одним из ведущих голосов в этой области. Пятнадцать лет назад он помог разработать то, что в конечном итоге стало CBS Sports Network. Его последнее предприятие — Simplebet, платформа, которая позволяет фанатам делать «микроставки» — реальные Ставки по времени на то, будет ли следующая подача мячом или ударом, отдаст ли Патрик Махоумс или отпасует. Микроставки — это будущее, поскольку все больше штатов разрешают ставки на одну игру. Это также не обязательно улучшает впечатления от игры на стадионе.

«Поколение фанатов, которые больше не смотрят телевизор, они сидят на мобильных устройствах.Вот куда должен пойти маркетинг этого вида спорта, — сказал Бевилаква. — Вы должны продвигать совершенно новую фанатскую базу, которая не смотрит свои телевизоры». внутриигровой опыт, по словам Р. Дж. Уайта, главного редактора SportsLine, веб-сайта, посвященного азартным играм и фэнтези-спорту, принадлежащему CBS Sports. «Если бы это был Суперкубок, то было бы так много реквизита, так много внимания было уделено этому.Вы не получите этого для большинства студенческих игр. … Вот тут-то и начинается самое интересное, три часа заниматься спортом, имея возможность делать ставки на события в игре. весело провести время на игре с 50 000 ваших самых близких друзей, болеющих за команду. Но с точки зрения просмотра игры, гораздо лучше делать это дома.»

Дома меньше беспокойства о времени начала игры, которое иногда устанавливается сетями, так как немногие из них были за шесть дней до начала матча. Из-за этого фанатам сложнее планировать заранее. AD Алабамы Грег Бирн и AD Оклахомы Джо Кастильоне жаловались на то, что 11:00 CT начинает влиять на посещаемость.

В конце концов, эти правообладатели платят миллионы долларов, чтобы они могли диктовать время начала игры. Игры стартуют в самые выгодные для сетей окна для показа рекламы и получения рейтингов, таким образом окупая миллионы, которые они платят за эти права.

В таком случае, кажется, что личный вентилятор почти второстепенный.Только не говори Арканзасу.

«У нас были люди, у которых есть люди, которые путешествуют по нашему штату на 11-часовую игру», — сказал Юрачек. «Вы говорите о поездке по штатам 3-4-5 часов. Это обязательство на весь день».

Avantor Seradigm Фетальная бычья сыворотка премиум-класса (FBS)

Положения и условия

Спасибо, что посетили наш сайт. Настоящие условия использования применимы к веб-сайтам США, Канады и Пуэрто-Рико («Веб-сайт»), которыми управляет VWR («Компания»). Если вы заходите на веб-сайт из-за пределов США, Канады или Пуэрто-Рико, посетите соответствующий международный веб-сайт, доступный по адресу www.vwr.com, для ознакомления с применимыми условиями. На всех пользователей веб-сайта распространяются следующие условия использования веб-сайта (данные «Условия использования»). Пожалуйста, внимательно прочитайте настоящие Условия использования перед доступом к любой части веб-сайта или его использованием. Получая доступ к Веб-сайту или используя его, вы соглашаетесь с тем, что прочитали, поняли и согласны соблюдать настоящие Условия использования с периодическими изменениями, а также Политику конфиденциальности Компании, которая настоящим включена в настоящие Условия. использования. Если вы не хотите соглашаться с настоящими Условиями использования, не открывайте и не используйте какую-либо часть веб-сайта.

Компания может пересматривать и обновлять настоящие Условия использования в любое время без предварительного уведомления, разместив измененные условия на веб-сайте. Ваше дальнейшее использование веб-сайта означает, что вы принимаете и соглашаетесь с пересмотренными Условиями использования. Если вы не согласны с Условиями использования (в которые время от времени вносятся поправки) или недовольны Веб-сайтом, вашим единственным и исключительным средством правовой защиты является прекращение использования Веб-сайта.

Использование на месте

Информация, содержащаяся на этом веб-сайте, предоставляется только в информационных целях. Несмотря на то, что на момент публикации информация считается верной, вы должны самостоятельно определить ее пригодность для вашего использования. Не все продукты или услуги, описанные на этом веб-сайте, доступны во всех юрисдикциях или для всех потенциальных клиентов, и ничто в настоящем документе не предназначено в качестве предложения или ходатайства в какой-либо юрисдикции или любому потенциальному клиенту, если такое предложение или продажа не соответствуют требованиям.

Покупка товаров и услуг

Настоящие Положения и условия применяются только к использованию Веб-сайта. Обратите внимание, что условия, касающиеся обслуживания, продажи продуктов, рекламных акций и других связанных с этим действий, можно найти по адресу https://us.vwr.com/store/content/externalContentPage.jsp?path=/en_US/about_vwr_terms_and_conditions.jsp. , и эти положения и условия регулируют любые покупки продуктов или услуг у Компании.

Интерактивные функции

Веб-сайт может содержать службы доски объявлений, чаты, группы новостей, форумы, сообщества, персональные веб-страницы, календари и/или другие средства обмена сообщениями или средствами связи, предназначенные для того, чтобы вы могли общаться с широкой общественностью или с группой ( совместно именуемые «Функция сообщества»).Вы соглашаетесь использовать Функцию сообщества только для публикации, отправки и получения сообщений и материалов, которые являются надлежащими и связаны с конкретной Функцией сообщества. Вы соглашаетесь использовать Веб-сайт только в законных целях.

A. В частности, вы соглашаетесь не делать ничего из следующего при использовании функции сообщества:

1. Порочить, оскорблять, преследовать, преследовать, угрожать или иным образом нарушать законные права (такие как права на неприкосновенность частной жизни и публичность) других лиц.
2. Публиковать, публиковать, загружать, распространять или распространять любые неуместные, богохульные, клеветнические, нарушающие авторские права, непристойные, непристойные или незаконные темы, имена, материалы или информацию.
3. Загружать файлы, содержащие программное обеспечение или другие материалы, защищенные законами об интеллектуальной собственности (или правами на неприкосновенность частной жизни или публичность), если только вы не владеете правами на них или не контролируете их, или не получили все необходимые согласия.
4. Загружать файлы, содержащие вирусы, поврежденные файлы или любое другое подобное программное обеспечение или программы, которые могут нарушить работу чужого компьютера.
5. Перехват или попытка перехвата электронной почты, не предназначенной для вас.
6. Рекламировать или предлагать продать или купить какие-либо товары или услуги для любых деловых целей, если такая Функция сообщества специально не разрешает такие сообщения.
7. Проводить или рассылать опросы, конкурсы, финансовые пирамиды или письма счастья.
8. Загружайте любой файл, опубликованный другим пользователем Элемента сообщества, который, как вы знаете или обоснованно должен знать, не может быть законно распространен таким образом или что у вас есть договорные обязательства по сохранению конфиденциальности (несмотря на его доступность на веб-сайте).
9. Фальсифицировать или удалять любые указания на авторство, юридические или другие надлежащие уведомления, обозначения прав собственности или ярлыки происхождения или источника программного обеспечения или других материалов, содержащихся в загружаемом файле.
10. Искажать связь с каким-либо лицом или организацией.
11. Участвовать в любых других действиях, которые ограничивают или препятствуют использованию кем-либо Веб-сайта или которые, по определению Компании, могут нанести вред Компании или пользователям Веб-сайта или привлечь их к ответственности.
12. Нарушать любые применимые законы или правила или нарушать любой кодекс поведения или другие правила, которые могут применяться к какой-либо конкретной функции сообщества.
13. Собирать или иным образом собирать информацию о других, включая адреса электронной почты, без их согласия.

B. Вы понимаете и признаете, что несете ответственность за любой контент, который вы отправляете, вы, а не Компания, несете полную ответственность за такой контент, включая его законность, надежность и уместность. Если вы публикуете от имени или от имени вашего работодателя или другого лица, вы заявляете и гарантируете, что вы уполномочены делать это. Загружая или иным образом передавая материал в любую область Веб-сайта, вы гарантируете, что этот материал принадлежит вам или находится в общественном достоянии, или иным образом свободен от имущественных или других ограничений, и что вы имеете право размещать его на Веб-сайте. Кроме того, загружая или иным образом передавая материалы в любую область веб-сайта, вы предоставляете Компании безотзывное, безвозмездное право во всем мире публиковать, воспроизводить, использовать, адаптировать, редактировать и/или изменять такие материалы любым способом, в любые средства массовой информации, известные в настоящее время или обнаруженные в будущем, во всем мире, в том числе в Интернете и всемирной паутине, в рекламных, коммерческих, коммерческих и рекламных целях, без дополнительных ограничений или компенсации, если это не запрещено законом, и без уведомления, проверки или одобрения.

C. Компания оставляет за собой право, но не берет на себя никакой ответственности, (1) удалять любые материалы, размещенные на веб-сайте, которые Компания по своему собственному усмотрению считает несовместимыми с вышеизложенными обязательствами или иным образом неуместными по любой причине. ; и (2) прекратить доступ любого пользователя ко всему Веб-сайту или его части. Тем не менее, Компания не может ни просматривать все материалы до их размещения на Веб-сайте, ни гарантировать незамедлительное удаление нежелательных материалов после их размещения.Соответственно, Компания не несет ответственности за какие-либо действия или бездействие в отношении передач, сообщений или контента, предоставленных третьими лицами. Компания оставляет за собой право предпринимать любые действия, которые она сочтет необходимыми для защиты личной безопасности пользователей данного веб-сайта и общественности; однако Компания не несет ответственности перед кем-либо за выполнение или невыполнение действий, описанных в этом параграфе.

D. Несоблюдение вами положений (A) или (B) выше может привести к прекращению вашего доступа к Веб-сайту и может подвергнуть вас гражданской и/или уголовной ответственности.

Особое примечание о контенте сообщества

Любой контент и/или мнения, загруженные, выраженные или представленные через любую функцию сообщества или любой другой общедоступный раздел веб-сайта (включая защищенные паролем области), а также все статьи и ответы на вопросы, кроме контента, явно разрешенного Компании, являются исключительно мнением и ответственностью физического или юридического лица, представляющего их, и не обязательно отражают мнение Компании. Например, любое рекомендуемое или предлагаемое использование продуктов или услуг, доступных от Компании, которое публикуется через Функция сообщества, не является признаком одобрения или рекомендации со стороны Компании. Если вы решите следовать любой такой рекомендации, вы делаете это на свой страх и риск.

Ссылки на сторонние сайты

Веб-сайт может содержать ссылки на другие веб-сайты в Интернете. Компания не несет ответственности за содержание, продукты, услуги или практику любых сторонних веб-сайтов, включая, помимо прочего, сайты, связанные с Веб-сайтом или с него, сайты, размещенные на Веб-сайте, или рекламу третьих лиц, и не делает заявлений относительно их качество, содержание или точность.Наличие ссылок с веб-сайта на любой сторонний веб-сайт не означает, что мы одобряем, одобряем или рекомендуем этот веб-сайт. Мы отказываемся от всех гарантий, явных или подразумеваемых, в отношении точности, законности, надежности или достоверности любого контента на любом стороннем веб-сайте. Использование вами сторонних веб-сайтов осуществляется на ваш страх и риск и регулируется условиями использования таких веб-сайтов.

Права собственности на контент

Вы признаете и соглашаетесь с тем, что все содержимое Веб-сайта (включая всю информацию, данные, программное обеспечение, графику, текст, изображения, логотипы и/или другие материалы), а также его дизайн, выбор, сбор, размещение и сборка являются являются собственностью Компании и защищены законами США и международными законами об интеллектуальной собственности.Вы имеете право использовать содержимое веб-сайта только в личных целях или в законных деловых целях. Вы не можете копировать, изменять, создавать производные работы, публично демонстрировать или выполнять, переиздавать, хранить, передавать, распространять, удалять, удалять, дополнять, добавлять, участвовать в передаче, лицензировать или продавать любые материалы в Интернете. сайта без предварительного письменного согласия Компании, за исключением: (а) временного хранения копий таких материалов в оперативной памяти, (б) хранения файлов, которые автоматически кэшируются вашим веб-браузером для целей улучшения отображения, и (в) печати разумного количество страниц веб-сайта; при условии, что в каждом случае вы не изменяете и не удаляете какие-либо уведомления об авторских правах или других правах собственности, включенные в такие материалы. Ни название, ни какие-либо права интеллектуальной собственности на какую-либо информацию или материалы на Веб-сайте не передаются вам, а остаются за Компанией или соответствующим владельцем такого контента.

Товарные знаки

Название и логотип компании, а также все соответствующие названия, логотипы, названия продуктов и услуг, встречающиеся на веб-сайте, являются товарными знаками компании и/или соответствующих сторонних поставщиков. Их нельзя использовать или повторно отображать без предварительного письменного согласия Компании.

Отказ от ответственности

Компания не несет никакой ответственности за материалы, информацию и мнения, представленные на Веб-сайте или доступные через него («Контент сайта»). Вы полагаетесь на Контент Сайта исключительно на свой страх и риск. Компания отказывается от какой-либо ответственности за травмы или убытки, возникшие в результате использования любого Контента Сайта.
ВЕБ-САЙТ, СОДЕРЖИМОЕ САЙТА, ​​ПРОДУКТЫ И УСЛУГИ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМЫЕ НА ВЕБ-САЙТЕ ИЛИ ДОСТУПНЫЕ ЧЕРЕЗ ЕГО, ПРЕДОСТАВЛЯЮТСЯ НА УСЛОВИЯХ «КАК ЕСТЬ» И «КАК ДОСТУПНО», СО ВСЕМИ ОШИБКАМИ.НИ КОМПАНИЯ, НИ ЛЮБОЕ СВЯЗАННОЕ С КОМПАНИЕЙ ЛИЦО НЕ ДАЕТ НИКАКИХ ГАРАНТИЙ ИЛИ ЗАЯВЛЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ КАЧЕСТВА, ТОЧНОСТИ ИЛИ ДОСТУПНОСТИ ВЕБ-САЙТА. В ЧАСТНОСТИ, НО НЕ ОГРАНИЧИВАЯ ВЫШЕИЗЛОЖЕННОЕ, НИ КОМПАНИЯ, НИ ЛЮБОЕ СВЯЗАННОЕ С КОМПАНИЕЙ ЛИЦО НЕ ГАРАНТИРУЕТ И НЕ ЗАЯВЛЯЕТ, ЧТО ВЕБ-САЙТ, СОДЕРЖИМОЕ САЙТА ИЛИ УСЛУГИ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМЫЕ НА ВЕБ-САЙТЕ ИЛИ ЧЕРЕЗ ВЕБ-САЙТ, БУДУТ ТОЧНЫМИ, НАДЕЖНЫМИ, БЕЗОШИБОЧНЫМИ ИЛИ БЕСПЕРЕБОЙНЫМИ; ЧТО ДЕФЕКТЫ БУДУТ ИСПРАВЛЕНЫ; ЧТО ВЕБ-САЙТ ИЛИ СЕРВЕР, КОТОРЫЙ ДЕЛАЕТ ЕГО ДОСТУПНЫМ, НЕ СОДЕРЖАТ ВИРУСОВ ИЛИ ДРУГИХ ВРЕДНЫХ КОМПОНЕНТОВ; ИЛИ ЧТО ВЕБ-САЙТ БУДЕТ ОТВЕЧАТЬ ВАШИМ ПОТРЕБНОСТЯМ ИЛИ ОЖИДАНИЯМ.КОМПАНИЯ ОТКАЗЫВАЕТСЯ ОТ ВСЕХ ГАРАНТИЙ ЛЮБОГО РОДА, ЯВНЫХ ИЛИ ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ, ВКЛЮЧАЯ ЛЮБЫЕ ГАРАНТИИ КОММЕРЧЕСКОЙ ПРИГОДНОСТИ, ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕННОЙ ЦЕЛИ И НЕНАРУШЕНИЯ ПРАВ.
НИ ПРИ КАКИХ ОБСТОЯТЕЛЬСТВАХ КОМПАНИЯ, ЕЕ ЛИЦЕНЗИАРЫ ИЛИ ПОДРЯДЧИКИ НЕ НЕСУТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА ЛЮБОЙ УЩЕРБ ЛЮБОГО РОДА, ПО ЛЮБОЙ ПРАВОВОЙ ТЕОРИИ, ВОЗНИКШИЙ ИЗ ИЛИ В СВЯЗИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВАМИ ИЛИ НЕВОЗМОЖНОСТЬЮ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЕБ-САЙТА, ​​СОДЕРЖИМОГО САЙТА, ЛЮБЫЕ УСЛУГИ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМЫЕ НА ИЛИ ЧЕРЕЗ ВЕБ-САЙТ ИЛИ ЛЮБОЙ ССЫЛОЧНЫЙ САЙТ, ВКЛЮЧАЯ ЛЮБЫЕ ПРЯМЫЕ, КОСВЕННЫЕ, СЛУЧАЙНЫЕ, ОСОБЫЕ, КОСВЕННЫЕ ИЛИ ШТРАФНЫЕ УБЫТКИ, ВКЛЮЧАЯ, ПОМИМО ПРОЧЕГО, ТРАВМЫ, УПУЩЕННУЮ ПРИБЫЛЬ ИЛИ УЩЕРБ В РЕЗУЛЬТАТЕ ЗАДЕРЖКИ, ПЕРЕРЫВА В ОБСЛУЖИВАНИИ , ВИРУСЫ, УДАЛЕНИЕ ФАЙЛОВ ИЛИ ЭЛЕКТРОННЫХ СООБЩЕНИЙ, ИЛИ ОШИБКИ, УПУЩЕНИЯ ИЛИ ДРУГИЕ НЕТОЧНОСТИ НА ВЕБ-САЙТЕ ИЛИ СОДЕРЖИМОМ САЙТА ИЛИ УСЛУГАХ, НЕЗАВИСИМО ОТ НЕБРЕЖНОСТИ СО СТОРОНЫ КОМПАНИИ И БЫЛА ИЛИ НЕ УВЕДОМЛЕНА КОМПАНИЯ О ВОЗМОЖНОСТИ ЛЮБОЙ ТАКОЙ УЩЕРБ, ЕСЛИ НЕ ЗАПРЕЩЕНО ПРИМЕНИМЫМ ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВОМ.

Возмещение ущерба

Вы соглашаетесь ограждать и ограждать Компанию и ее должностных лиц, директоров, агентов, сотрудников и других лиц, связанных с Веб-сайтом, от любых и всех обязательств, расходов, убытков и издержек, включая разумные гонорары адвокатов, возникающие в результате любое нарушение вами настоящих Условий использования, использование вами веб-сайта или любых продуктов, услуг или информации, полученных с веб-сайта или через него, ваше подключение к веб-сайту, любой контент, который вы отправляете на веб-сайт через любую Функция сообщества или нарушение вами каких-либо прав другого лица.

Применимое законодательство; Международное использование

Настоящие условия регулируются и толкуются в соответствии с законами штата Пенсильвания без учета каких-либо принципов коллизионного права. Вы соглашаетесь с тем, что любой иск по закону или справедливости, который возникает из настоящих Условий использования или относится к ним, будет подан исключительно в суды штата или федеральные суды, расположенные в Пенсильвании, и настоящим вы соглашаетесь и подчиняетесь личной юрисдикции таких судов для целей судебного разбирательства любого такого действия.
Настоящие Условия использования применимы к пользователям в США, Канаде и Пуэрто-Рико. Если вы заходите на веб-сайт из-за пределов США, Канады или Пуэрто-Рико, посетите соответствующий международный веб-сайт, доступный по адресу www.vwr.com, для ознакомления с применимыми условиями. Если вы решите получить доступ к этому веб-сайту из-за пределов указанной юрисдикции, а не использовать доступные международные сайты, вы соглашаетесь с настоящими Условиями использования и тем, что такие условия будут регулироваться и толковаться в соответствии с законами Соединенных Штатов и штата. Пенсильвании, и что мы не делаем заявлений о том, что материалы или услуги на этом веб-сайте подходят или доступны для использования в этих других юрисдикциях.В любом случае, все пользователи сами несут ответственность за соблюдение местного законодательства.

Общие условия

Настоящие Условия использования, в которые время от времени могут вноситься поправки, представляют собой полное соглашение и понимание между вами и нами, регулирующее использование вами Веб-сайта. Наша неспособность осуществить или обеспечить соблюдение какого-либо права или положения Условий использования не означает отказ от такого права или положения. Если какое-либо положение Условий использования будет признано судом компетентной юрисдикции недействительным, вы, тем не менее, соглашаетесь с тем, что суд должен приложить усилия для реализации намерений сторон, отраженных в этом положении, и других положений Условия использования остаются в полной силе.Ни курс дел или поведение между вами и Компанией, ни какие-либо торговые практики не должны рассматриваться как изменяющие настоящие Условия использования. Вы соглашаетесь с тем, что независимо от любого закона или закона об обратном, любой иск или основание для иска, вытекающие из или связанные с использованием Сайта или Условий использования, должны быть поданы в течение одного (1) года после такого требования или основания. действия возникло или будет навсегда запрещено. Любые права, прямо не предоставленные в настоящем документе, сохраняются за Компанией и для нее. Мы можем прекратить ваш доступ или приостановить доступ любого пользователя ко всему Сайту или его части без предварительного уведомления за любое поведение, которое мы, по нашему собственному усмотрению, считаем нарушением любого применимого закона или наносящим ущерб интересам другого пользователя. , стороннего поставщика, поставщика услуг или нас. Любые вопросы, касающиеся настоящих Условий использования, следует направлять на адрес [email protected]

Жалобы на нарушение авторских прав

Мы уважаем чужую интеллектуальную собственность и просим наших пользователей делать то же самое.Если вы считаете, что ваша работа была скопирована и доступна на Сайте таким образом, что это представляет собой нарушение авторских прав, вы можете уведомить нас, предоставив нашему агенту по авторским правам следующую информацию:

  • электронная или физическая подпись лица, уполномоченного действовать от имени владельца авторского права;

  • описание защищенной авторским правом работы, права на которую были нарушены в соответствии с вашим заявлением;

  • указание URL-адреса или другого конкретного места на Сайте, где находится материал, который, по вашему мнению, нарушает авторские права;

  • ваш адрес, номер телефона и адрес электронной почты;

  • ваше заявление о том, что вы добросовестно полагаете, что оспариваемое использование не разрешено владельцем авторских прав, его агентом или законом; а также

  • ваше заявление, сделанное под страхом наказания за лжесвидетельство, о том, что приведенная выше информация в вашем уведомлении является точной и что вы являетесь владельцем авторских прав или уполномочены действовать от имени владельца авторских прав.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.